3-1-5 منحنی ذوب…………………………………………………………………………………………………… 37

 

3-1-6 اصطلاحات موجود در Real time PCR……………………………………………………………. 38

 

3-2 روش کار………………………………………………………………………………………………………….. 38

 

3-2-1 مرحله اول: انتخاب بیمار………………………………………………………………………………….. 39

 

3-2-2مرحله دوم: تهیه سرم از بیمار………………………………………………………………………………. 39

 

3-2-3 مرحله سوم: استخراج RNA از سرم……………………………………………………………………… 39

 

3-2-4 آماده سازی محلول های لازم برای کیت استخراج RNA از سرم………………………………….. 40

 

3-2-5 ارزیابی بازده و کیفیت RNA ی جدا شده……………………………………………………………… 41

 

3-2-6 واکنش رونویسی معکوس…………………………………………………………………………………. 43

 

3-2-7 انجام واکنش Real Time PCR…………………………………………………………………………. 44

 

3-2-8 تعیین سیگنال پایه…………………………………………………………………………………………… 54

 

3-2-8 تعیین سیکل آستانه………………………………………………………………………………………….. 54

 

3-2-8 آنالیز منحنی ذوب…………………………………………………………………………………………… 46

 

3-3-1 محاسبه میزان miRNA-21 نمونه های تحت مطالعه………………………………………………… 47

 

3-3-2 آنالیز آماری داده ها………………………………………………………………………………………….. 48

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1 خصوصیات بیماران و ویژگی‌های پاتولوژیکی آنها………………………………………………………. 49

 

4-2 وضعیت بیان مارکر miRNA-21 و ارتباط آن با فاکتورهای پاتولوژیکی…………………………… 50

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه‌گیری

 

   5-1- بحث …………………………………………………………………………………………………………. 55

 

   5-2- نتیجه‌گیری ………………………………………………………………………………………………….. 61

 

منابع ……………………………………………………………………………………………………………………. 62

 

چکیده انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………….. 68

 

فرضیه‌ها:

 

 با توجه به آنکه miR-21 توسط بافت توموری سرطان معده بیشتر از بافت سالم تولید می شود، لذا انتظار می رود که میزان سرمی آن نیز در بیماران نسبت به افراد کنترل بطور قابل توجهی بالاتر برود و نیز این افزایش با مرحله بندی(staging) تومور آدنوکارسینومای معده در بیماران ارتباط داشته باشد.

 

-آیا میزان miR-21ی سرم نشانگر قابل اعتماد برای تشخیص زودهنگام آدنوکارسینومای معده در مقایسه با افراد کنترل است؟

 

-آیا هرچه میزان غلظت miR-21 در سرم بیشتر باشد مرحله بندی (staging) تومور در بیماران مبتلا به آدنوکارسینومای معده پیشرفته تر است؟

 

-آیا بیان بالای miR-21 با پیشرفت سرطان ارتباط مستقیم دارد؟

 

هدف كلی:

 

   ارتباط میزان miR-21 در سرم با پارامترهای تشخیصی و کلینیکوپاتولوژیکی (مانند مرحله بندی تومور) در بیماران مبتلا به آدنوکارسینومای معده

 

اهداف اختصاصی :

 

– تعیین میزان miR-21 در سرم افراد مبتلا به آدنوکارسینومای معده

 

– تعیین میزان miR-21 در سرم افراد کنترل

 

– ارتباط بین میزان miR-21 سرم و مرحله بندی تومور در بیماران

 

   -تعیین مرحله بندی های (staging های I، II، III و IV) تومور افراد مبتلا به آدنوکارسینومای معده

 

 اهداف كاربردی:

 

ارزیابی ارزش تشخیصی میزان miR-21 در سرم به عنوان بیومارکری غیر تهاجمی در تشخیص زود هنگام   (stage های اولیه تومور) آدنوکارسینومای معده و نیز افتراق دادن بیماران از افراد کنترل

 

چکیده

 

مقدمه: میکروRNA ها گروه جدیدی از RNA های تنظیمی هستند که حدود 22 نوکلئوتید طول دارند. همچنین میکروRNA ها در بسیاری از سرطان های انسانی نقش دارند، و ظاهرا هم به عنوان انکوژن و هم به عنوان سرکوبگر تومور عمل می کنند. در این بررسی ارتباط بین میزان mir-21 در سرم افراد بیمار و سالم و ارتباط بیان بالای این میکروRNA با مرحله بندی تومور و پیشرفت سرطان برای اولین بار در ایران بر روی سرطان آدنوکارسینومای معده انجام گرفت.                                      

 

روش کار: در این مطالعه بر روی 40 بیمار مبتلا به سرطان آدنوکارسینومای معده و 40 بیمار که بعلت ناراحتی گوارشی مراجعه کرده اند ولی بعد از تشخیص سالم و یا غیر سرطانی بوده اند نیز بعنوان گروه شاهد انتخاب گردیدند میزان miR-21 سرم آنها با استفاده از تکنیک Real-Time PCR اندازه گیری گردید وارتباط بین بیان این میکرو RNA با مرحله بندی تومور و پیشرفت سرطان مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

 

نتایج: افزایش بیان mir-21 در نمونه‌های سرمی، میزان miR-21 سرم در بیماران حدود 5/3 برابر افراد کنترل بود ( 0001/0 p< ) ، میزان miR-21 سرم در بیماران ارتباط معنی داری با مرحله بندی تومور نشان داد (01/0p< ،56/0 =τ)، نشانگر ارتباط معنی‌دار و مستقیم mir-21 با افزایش اندازه تومور میباشد که بیانگر اهمیت این میکروRNA در پیشرفت سرطان معده است.                                            

 

نتیجه‌گیری: با توجه به نقش mir-21 در پیشرفت سرطان معده و سرطان‌های مختلف و با توجه به ارتباط آن با فاکتورهای کلینیکوپاتولوژیکی، می‌توان آن را به عنوان مارکر تشخیصی جدید و به عنوان یک روش غیر تهاجمی در تشخیص زود هنگام بیماران سرطان آدنوکارسینومای معده معرفی کرد. در این بررسی، mir-21 نقش انکوژنی دارد که با سنجش میزان آن در سرم بیماران می‌توان پیشرفت سرطان معده را بررسی کرد.

 

واژه های کلیدی: آدنوکارسینومای معده، میکروRNA، mir-21

 

مقدمه:

 

 سرطان نتیجه خروج سلول ها از مسیرهاى درست تنظیمى، تكثیری، و تمایزی است. خودكارآمدی در سیگنال هاى رشد، غیرحساس شدن به سیگنال هاى مهاركننده رشد، اجتناب از مرگ سلولى برنامه ریزى شده، پتانسیل نامحدود تكثیر، حفظ رگ زایى و تهاجم بافتى و متاستاز منجر به بدخیم شدن سرطان می شوند. برهمکنش میکرو RNA ها با ژن های هدف، نقش آنها را در رشد، مرگ برنامه ریزی شده، تمایز و تکثیر سلولی مشخص کرده و عملکرد مستقیم میکرو RNA را در سرطان تایید میکند. می توان از بیان میکرو RNA های غالب برای طبقه بندی سرطانها در گروههایی با ویژگى هاى متفاوت مثل نوع سلول و سبب شناسى استفاده كرد. استفاده از میکرو RNA برای طبقه بندی تومور به مراتب مناسب تر از mRNA مى باشد،این امر به علت جفت شدگی ناقص بین میكرو RNA و mRNA های هدف است، از این رو ریز سنج های میكرو RNA میتوانند بیان چند صد ژن و در نتیجه مسیر های متعدد را در یك نمونه شناسایی كنند، در حالی كه تنها به مقادیر كمی از RNA کل نیاز دارند. ساختار میکرو RNA ها و نحوه عملکرد آنها نشان میدهد که بسیاری از میکرو RNA ها در نمونه های سرطانی به صورت غیر طبیعی بیان میشوند. علاوه بر این، تفاوت هاى عملكردى بین انواع تومورها و مراحل مختلف سرطان با بیان میكروRNA ها مرتبط است. بیان میکروRNA با ویژگى هاى بالینى و زیستی تومور از قبیل نوع بافت، تمایز، تهاجم و پاسخ به درمان مرتبط است. استفاده از میکرو RNA ها به عنوان نشان گرهاى تشخیصى از طریق بررسى سرم یا پلاسماى انسانى امكان پذیر است، از این رو مى توان میكروRNA های سرطانی و سلول های توموری موجود در سرم یا پلاسما را بدون هیچ گونه روش تهاجمی شناسایى كرد. به استثناى لوسمى ها كه سلول هاى بدخیم به آسانى در دسترس هستند. برای سرطان هاى جامد، نمونه برداری بافت از طریق بیوپسى یا جراحی انجام می گیرد، و چون معمولاً جراحى زمانى صورت مى گیرد كه سرطان به میزان قابل توجهی پیشرفت نموده، تشخیص آن چندان مفید نمیباشد. در این موارد استفاده از میکرو RNA ها یی که با فنوتیپ هاى بدخیم ارتباط تنگاتنگ دارند به عنوان نشان گرهاى تشخیصى جهت تشخیص بیماری در مراحل آغازین آن بسیار کمک کننده است. با در نظر گرفتن این واقعیت كه اغلب روش هاى رایج براى غربال گرى سرطان در مراحل اولیه قادر به تشخیص بیمارى نمى باشند، شناسایى میکرو RNA های توموری که طی پیشرفت تدریجی بیماری در جریان خون منتشر میشوند، روش کلیدی در تشخیص به موقع سرطان محسوب میشود.

 

 فصل اول

 

کلیات تحقیق

 

 

• آشنایی با سرطان

 

بدن انسان از تریلیونها سلول زنده ساخته شده که این سلولها در یک بدن طبیعی رشد میکنند، تقسیم میشوند تا سلولهای جدید را بوجود بیاورند و در نهایت به یک شکل منظم میمیرند. در طی سالهای اولیه زندگی یک فرد سلولها سریع تر تقسیم میشوند تا به فرد اجازه رشد بدهند، بعد از اینکه فرد بالغ شد و به بلوغ رسید، اکثر سلولها فقط برای جایگزین شدن با سلولهای فرسوده و یا سلولهای در حال مرگ ویا بازسازی جراحات تقسیم میشوند( et al., 2011 Avital). سرطان زمانی آغاز میشود که سلولها در یک قسمت از بدن شروع به رشد خارج از کنترل کنند، انواع مختلفی از سرطانها وجود دارد اما ویژگی مشترک در تمامی سرطانها رشد غیر طبیعی و خارج از کنترل سلولها میباشد رشد سلولهای سرطانی متفاوت از رشد سلولهای عادی است بطوریکه سلولهای سرطانی به جای داشتن یک مرگ طبیعی به رشد خود در شکل و فرم جدیدی در غالب سلولهای غیر عادی و ناهنجار ادامه میدهند. یکی از توانایی های منحصر به فرد سلولهای سرطانی که آنها را از سلولهای عادی متمایز میسازد توانایی حمله به دیگر بافتهای بدن میباشد(Hanahan D et al., 2011). رشد خارج از کنترل، تهاجم به بافتهای دیگر یک سلول را به سلولی سرطانی تبدیل میکند. سلولها به دلیل صدمه به DNA سرطانی میشوند، وظیفه DNA در سلولها مدیریت تمامی اعمال آنهاست. در یک سلول طبیعی وقتی DNA دچار آسیب میشود سلول میکوشد که آسیب را ترمیم کند در صورت عدم ترمیم سلول میمیرد. در سلولهای سرطانی DNA آسیب دیده ترمیم نمیشود و سلول نمیمیرد، سلول سرطانی با همان DNA آسیب دیده شروع به تقسیم میکند و به جای مردن توده ای از سلول هایی را بوجود می آورد که همان آسیب DNA را دارند. در اغلب موارد سلولهای سرطانی که تومور را تشکیل میدهند به سایر نقاط بدن سفر میکنند و در بافتهای طبیعی شروع به رشد و تکثیر تومورهای جدید میکنند، به این روند متاستاز میگویند. متاستاز زمانی اتفاق می افتد که سلولهای سرطانی به جریان خون، لنف یا عروق بدن راه پیدا کنند(et al., 2014 Atlanta Ga ).

 

یکی از عامل های مهم در درمان سرطان فهمیدن این موضوع است که سرطان از کجا شروع شده و منشا آن کجاست، به عنوان مثال سرطان سینه ای که به کبد گسترش یافته است همان سرطان سینه است، یا سرطان پروستاتی که به استخوان انتشار یافته کماکان سرطان پروستات نامیده میشود. انواع مختلف سرطان می تواند بسیار متفاوت رفتار کند به عنوان مثال سرطان های سینه و ریه بیمار ی های بسیار متفاوتی هستند به روش های مختلف رشد می کنند و پاسخ به درمان آنها متفاوت است به همین دلیل هر سرطان درمان خاص خود را دارد. همه ی تومورها سرطانی نیستند به تومورهای غیر سرطانی خوش خیم میگویند. تومورهای خوش خیم نیز میتوانند باعث بروز مشکلاتی شوند آنها میتوانند رشد کنند، بزرگ شوند وبه سایر بافت ها و اندام های دیگر فشار بیاورند آنها همچنین قدرت متاستاز ندارند و ازین جهت تهدیدی برای زندگی نیستند(Benusiglio PR et al., 2008).

 

1-2- سرطان معده

 

برای اینکه درک بهتری از هر سرطان داشته باشیم در ابتدا باید ساختار طبیعی و عملکرد آن بافت را بدانیم پس در ابتدا به تشریح ساختار معده میپردازیم.

 

معده اندامی است کیسه مانند که مواد غذایی را نگه میدارد و آن را با ترشح شیره معده هضم میکند. معده از پنج بخش تشکیل شده است: کاردیا(cardia) ،فندوس(fundus) ،بادی(body) ،آنتروم(antrum) ،پیلروس(pylorus) . سه قسمت ابتدایی معده بنام معده پروگزیمال خوانده میشوند، و دو قسمت انتهایی نیز معده دیستال نامیده میشوند. دیواره معده دارای پنج لایه میباشد، درونی ترین لایه مخاط میباشد در این لایه اسید معده و آنزیم های گوارشی ساخته میشود و بیشتر سرطان های معده از این لایه شروع میشود. دومین لایه که بعد از لایه ی مخاط قرار گرفته است زیر مخاط(sub mucosa)، نامیده میشود، سومین لایه که لایه ی ضخیم عضلانی است، کار آن مخلوط کردن محتویات معده میباشد بنام آستر عضلانی( muscularis propria)، خوانده میشود.