1-1- آنزیم­ها

 

 

2

 

 

 

1-2- لیپازها

 

 

3

 

 

 

1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن

 

 

5

 

 

 

1-3- آنزیم­ها در محیط آلی

 

 

6

 

 

 

1-4- مایعات یونی

 

 

8

 

 

 

1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی

 

 

9

 

 

 

1-5-1- آنزیم­ها در مخلوط­های مایع یونی – آب

 

 

10

 

 

 

1-5-2- فعالیت آنزیم­ها در شرایط نسبتا بی­آب در مایعات یونی

 

 

11

 

 

 

1-5-3- پایداری آنزیم­ها در مایعات یونی تقریبا بی­آب

 

 

13

 

 

 

1-5-4- آنزیم­ها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت

 

 

13

 

 

 

1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپاز­ها و استرازها

 

 

14

 

 

 

1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس

 

 

15

 

 

 

فصل دوم: بر پژوهش­های پیشین

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز

 

 

18

 

 

مقالات و پایان نامه ارشد

 

 

2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم

 

 

19

 

 

 

2-3- بررسی ساختار آنزیم­ها در مایعات یونی

 

 

22

 

 

 

اهداف

 

 

23

 

 

 

فرضیه

 

 

23

 

 

 

فصل سوم: مواد و روش­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3-1- ابزار

 

 

25

 

 

 

 

 

 

عنوان

 

صفحه

 

 

 

3-2- مواد

 

 

26

 

 

 

3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی

 

 

26

 

 

 

3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL

 

 

26

 

 

 

3-2-2-1- سوش باکتری

 

 

26

 

 

 

3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون

 

 

26

 

 

 

3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی

 

 

26

 

 

 

3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز

 

 

26

 

 

 

3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE

 

 

27

 

 

 

3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز

 

 

27

 

 

 

3-2-4- نرم افزارها

 

 

27

 

 

 

3-3- روش­ها

 

 

28

 

 

 

3-3-1- روش تهیه مایعات یونی

 

 

28

 

 

 

3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید

 

 

28

 

 

 

3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات

 

 

28

 

 

 

3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب

 

 

29

 

 

 

3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli

 

 

29

 

 

 

3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli

 

 

29

 

 

 

3-3-2-2-1-  تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی

 

 

29

 

 

 

3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد

 

 

30

 

 

 

3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری

 

 

31

 

 

 

3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب

 

 

31

 

 

 

3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب

 

 

31

 

 

 

3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL

 

 

31

 

 

 

3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا

 

 

32

 

 

 

3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL

 

 

32

 

 

 

3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL

 

 

33

 

 

 

3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی

 

 

33

 

 

 

3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی

 

 

33

 

 

 

3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی

 

 

33

 

 

 

3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین

 

 

34

 

 

 

3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد

 

 

34

 

 

 

3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280

 

 

34

 

 

 

 

 

 

عنوان

 

صفحه

 

 

 

3-3-5- الکتروفورز ژل پلی­آکریل آمید با SDS (SDS-PAGE)

 

 

35

 

 

 

3-3-5-1- آماده سازی محلول­های الکتروفور

 

 

35

 

 

 

3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز

 

 

36

 

 

 

3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات

 

 

38

 

 

 

3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی

 

 

39

 

 

 

3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا

 

 

39

 

 

 

3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف

 

 

39

 

 

 

3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی

 

 

40

 

 

 

فصل چهارم: نتایج

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب

 

 

42

 

 

 

4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL

 

 

43

 

 

 

4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا

 

 

43

 

 

 

4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL

 

 

44

 

 

 

4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی

 

 

44

 

 

 

4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز

 

 

45

 

 

 

4-3- سنتز مایعات یونی

 

 

47

 

 

 

4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL

 

 

47

 

 

 

4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL

 

 

48

 

 

 

4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی

 

 

48

 

 

 

4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی

 

 

49

 

 

 

4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف

 

 

49

 

 

 

4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی

 

 

51

 

 

 

4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طول­های مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم

 

 

51

 

 

 

4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی

 

 

54

 

 

 

فصل پنجم: بحث

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL

 

 

57

 

 

 

 

 

 

عنوان

 

صفحه

 

 

 

5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL

 

 

59

 

 

 

5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی

 

 

61

 

 

 

فصل ششم: نتیجه­گیری و پیشنهادات

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6-1- نتیجه­گیری

 

 

63

 

 

 

6-2- پیشنهادات

 

 

63

 

 

 

فهرست منابع

 

 

65

 

 

 

چکیده انگلیسی

 

 

75

 

 

فهرست جدول­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان

 

 

 

صفحه

 

 

 
جدول1-1- میکروارگانیسم­های تولید کننده لیپاز 4
جدول2-1- آنیون­های متداول در مایعات یونی 19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani 29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB 30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM 31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد 34
جدول 3-5-  نحوه تهیه بافر نمونه 4X 37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید 37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم 38
جدول 4-1- فعالیت­های لیپازی عصاره­های سلولی کلنی­های 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون 44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. 46
جدول 5-1- غلظت­های بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه 58

 

فهرست شکل­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ی نوشته‌ها


 
 
 
tbody>