فصل دوم :مرور منابع

 

2-1- انتخاب ریزنمونه و ترکیب محیط کشت.. 21

 

2-2- دما و نور. 26

 

2-3- جنین زایی سوماتیکی.. 27

 

فصل سوم :مواد و روش‌ها

 

3-1- تهیه مواد گیاهی.. 32

 

3-2- ریزازدیادی.. 32

 

3-2-1- گند زدایی ریزوم‌ها 32

 

3-2-2- محیط کشت تکثیر. 33

 

3-2-3- تهیه و کشت ریزنمونه. 34

 

3-2-4- طرح آزمایشی و تجزیه و تحلیل آماری.. 34

 

3-3- جنین زایی سوماتیک… 36

 

3-3-1- تهیه محیط القاء کالوس… 36

 

3-3-2- ضدعفونی نمونه‌ها 36

 

3-3-3- تهیه و کشت ریزنمونه گره و میانگره 37

 

3-3-4- محیط پرآوری کالوس… 37

 

3-3-5- محیط کشت باززایی.. 38

 

3-3-6- طرح آزمایش و تجزیه و تحلیل آماری.. 38

 

فصل چهارم :نتایج و بحث

 

4-1- نتایج حاصل از آزمایشات صورت گرفته بر روی ریزازدیادی آلسترومریا رقم Fuego. 40

 

4-1-1- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی تعداد جوانه. 45

 

4-1-2- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی تعداد شاخه. 47

 

4-1-3- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی طول شاخه. 49

 

4-1-4- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی تعداد ریشه. 51

 

4-1-5- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی طول ریشه. 54

 

4-1-6- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی تعداد ریزوم. 56

 

4-2- نتایج حاصل از آزمایشات جنین زایی سوماتیک صورت گرفته در محیط کشت MS. 59

 

4-2-1- مرحله القاء کالوس… 60

 

4-2-1-1- اثر نوع ریزنمونه بر کالوس زایی.. 61

 

4-2-1-2- اثر BAP بر کالوس زایی.. 62

 

3-2-1-3- اثر NAA بر کالوس زایی.. 63

 

4-2-1-4- اثر متقابل نوع ریزنمونه و نوع BAP بر کالوس زایی.. 64

 

4-2-1-5- اثر متقابل نوع ریزنمونه و نوع NAA بر کالوس زایی.. 64

 

4-2-1-6- اثر متقابل نوع BAP و نوع NAA بر کالوس زایی.. 65

 

4-2-1-7- مقایسه تیمارهای اعمال شده با تیمار شاهد. 66

 

4-2-2- پرآوری کالوس… 66

 

4-2-4- بحث و نتیجه گیری.. 67

 

منابع. 69

 

چکیده

 

 گل آلسترومریا با نام علمی(Alstroemeria psittacina)از خانواده ((Alstroemeriaceaeیکی از مهم ترین گلهای شاخه بریده در دنیا بوده که اخیراً برای تولید گلهای گلدانی و باغچه ای نیز استفاده می شود. این تحقیق به منظور بررسی و معرفی محیطی مناسب جهت ریزازدیادی و تولید کالوس های جنینی و جنین زایی سوماتیکی آلسترومریا انجام شد.

 

در بخش ریزازدیادی، جوانه های جانبی و انتهایی ریزوم به طول  mm 6-4 از رقم فیگو پس از گندزایی بر روی محیط کشت MS حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز، 7 گرم در لیتر آگار و غلظت های مختلف BAP و NAA کشت شدند و به فواصل هر 3 هفته واکشت شدند. جوانه های کشت شده از هفته سوم شروع به رشد نمودند. بیشترین تعداد شاخساره از محیط کشت حاوی 1 میلی گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی گرم در لیتر NAA حاصل شد. همچنین نتایج نشان داد که با افزایش غلظت BAP به دلیل کاهش اثر غالبیت انتهایی، طول شاخساره ها کاهش یافته است. همچنین مقدار کم NAA جهت رشد شاخساره و ریزوم های اولیه ضروری بوده است. از آنجایی که در تکثیر آلسترومریا، تعداد ریزوم تکثیر یافته از تعداد شاخساره مهم تر می باشد، درنتیجه محیط کشت حاوی صفر میلی گرم در لیتر BAP و 1 میلی گرم در لیتر NAA با میانگین تعداد 3 ریزوم و 5 ریشه در هر ریزنمونه بهترین تیمار برای ریزازدیادی آلسترومریا رقم فیگو بوده است.

 

آزمایشات جنین زایی سوماتیک نیز در محیط کشت MS انجام شد. در این محیط کشت به منظور به دست آوردن کالوس های جنین زا، ریزنمونه های رویشی (گره و میانگره) و هورمون اکسین NAA در دو سطح (غلظت 1 و 2 میلی گرم در لیتر) همراه با تنظیم کننده رشد سایتوکنین BAP در دو سطح (غلظت 0 و 5/0 میلی گرم در لیتر) مورد استفاده قرار گرفت. بهترین ریزنمونه جهت بدست آوردن کالوس های جنین زا، گره ها بودند. ریزنمونه های میانگره اگرچه مستعد تولید کالوس های جنینی بودند اما در مقایسه با گره ها دارای درصد کالوس زایی پائین تری بودند. بهترین تیمار هورمونی برای بدست آوردن کالوس های جنین زا، 2 میلی گرم در لیتر NAA بوده است. کالوس های به دست آمده، 3 ماه پس از کشت جهت پرآوری به محیط کشت MS تغییر داده شده حاوی 5 میلی گرم در لیتر پیکلرام منتقل شدند. جنین زایی سوماتیک و باززایی گیاه از این جنین ها، پس از انتقال کالوس های جنینی توده ای به محیط کشت باززایی حاوی غلظت های مختلف BAP صورت گرفت. بیشترین گیاهچه از محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی گرم در لیتر BAP حاصل شد.

 

کلمات کلیدی:آلسترومریا، ریزازدیادی، جنین زایی سوماتیک، نفتالین استیک اسید، بنزیل آمینو پورین.

 

 فصل اول

 

مقدمه و کلیات

 

1-1- مقدمه

 

 

فناوری کشت بافت و سلول در دومین انقلاب سبز، که بر اساس تغییر ژن و دستکاری ژنتیکی برای بهبود کیفیت و کمیت محصولات پایه گذاری شد، نقش کلیدی دارد. کشت بافت و سلول گیاهی به روشی گفته می‌شود که اجزای مختلف گیاه شامل سلول، پروتوپلاست، جنین، بافت، اندام و غیره در شرایط آزمایشگاهی و به طور کامل سترون روی یک محیط غذایی قرار می‌گیرند و در شرایط محیطی مناسب نگهداری می‌شوند. این روش در سطح کم وسعت در مقایسه با کشت های مزرعه‌ای و با استفاده از محیط غذایی مشخص و عاری از هر گونه آلودگی صورت می‌گیرد .

 

   روش‌های اصلی برای ایجاد کالوس‌دهی و باززایی، شامل روش‌هایی است که هم کاربرد تجاری مستقیم دارند و به همان اندازه نیز امکان پژوهش‌های پایه‌های ژنتیکی و بیو شیمیایی در سلول را فراهم می‌آورند. این روش‌ها شامل انواع کشت بافت و سلول‌های گیاهی، مانند بساک، تخمک (تخمدان)، بذر، ساقه، برگ، کالوس، جداسازی پروتوپلاست و امتزاج آنها، انتخاب سلول، کشت مریستم و جوانه، و همچنین تغییر ژنتیکی سلول‌ها و گیاهان است (سید طباطبایی و امیدی، 1388).

 

امروزه از تکنیک‌های کشت بافت در سراسر جهان به منظور تولید بسیاری از گیاهان با اهداف گوناگون استفاده می‌شود. این تکنیک‌ها دامنه وسیعی از روش‌های مختلف را بسته به محیط‌های کشت مورد استفاده، ریزنمونه مورد نظر، چگونگی انتقال از فازهای مختلف فرآیند و … را در بر می‌گیرند.

 

یکی از مهم‌ترین روش‌های کشت بافت، ریزازدیادی است که به منظور تکثیر انبوه گیاهان در زمانی کوتاه به کار می‌رود. در این روش از قسمت‌های مختلف گیاه ریزنمونه تهیه شده و با استفاده از ترکیبات غذایی و هورمونی مناسب مستقیماً به فاز باززایی هدایت می‌شوند. در واقع این تکنیک می‌تواند جایگزینی برای روش‌های سنتی تکثیر غیر جنسی در بسیاری از گیاهان باشد.

 

یک روش بسیار پرکاربرد ریزازدیادی کشت مریستم و نوک ساقه است. مریستم شامل سلول‌های به سرعت در حال تقسیم است، از این رو از این تکنیک برای تولید تجاری گیاهان و همین طور تولید گیاهان عاری از ویروس به طور وسیعی استفاده می‌شود. گیاهان به دست آمده از این طریق، پایداری ژنتیکی زیادی نشان می‌دهند، از این رو برای انجام تحقیقات بیوتکنولوژیکی بسیار مناسب هستند.

 

1-2- تاریخچه آلسترومریا

 

آلسترومریا (Alstromeria sp.)که در ایران با نام سوسن پرویی نیز خوانده می شود، گیاهی دگرگشن بوده که خاستگاه آن آمریکای جنوبی است. این جنس دارای گونه‌های فراوانی در خانواده آلسترومریاسه است که امروزه تعدادی از آنها به عنوان گیاهان زینتی برای تولید گل‌های شاخه بریده، گیاهان باغی، باغچه‌ای و یا گلدانی پرورش داده می‌شوند) باند و الدرسون، 1993).

 

درحال حاضر آلسترومریا به علت داشتن گل‌های زیبا و بادوام در بازارهای جهانی گل و گیاه به عنوان یکی از مهم‌ترین و پرطرفدارترین گل‌های زینتی شاخه بریده به شمار می‌رود (خالقی و همکاران، 2008).

 

آلسترومریا به طور معمول با استفاده از ریزوم تکثیر می‌شود، اما آلودگی‌های ویروسی، سرعت کم تکثیر و محدودیت‌های فصلی، سبب محدود شدن استفاده از این روش شده است (وان و همکاران، 1996).

 

شکل 1-1- نمونه‌هایی از گل آلسترومریا

 

شکل 1-2- گل آلسترومریا رقم Fuego

 

درحال حاضر برای فایق آمدن بر مشکلات روش‌های معمول تکثیر این گیاه زینتی و تولید گیاهان عاری از ویروس، استفاده از روش‌های کشت درون شیشه‌ای در این گیاه اهمیت زیادی پیدا کرده است. برای تکثیر این‌ویتروی آلسترومریا معمولاً از ریزنمونه‌های جوانه انتهایی شاخه (پدراز سانتوز و همکاران،2005)، جوانه جانبی (لین و همکاران، 1997) و ریزوم (لین و همکاران، 1987) استفاده می‌گردد. با این وجود سرعت باززایی جوانه انتهایی ریزوم (نوک ریزوم) از سایر ریزنمونه‌ها بیشتر گزارش شده است (لین و همکاران، 1987).

 

1-3- مشخصات گیاه‌شناسی آلسترومریا

 

آلسترمریا (Alstromeria) از گیاهان زیر رده تک لپه‌ایها متعلق به خانواده آلسترومریاسه می‌باشد. آلسترومریا گیاهی است علفی، چند ساله، ریزوم دار با گلهایی به رنگ‌های مختلف که حدود 60 گونه دارد که منشا همگی از جنوب آمریکا می‌باشد (بیکر، 1888؛ آفوت، 1952؛ رابینسون، 1963). آلسترومریا دارای انواع مختلفی می‌باشند که می‌توانند در شرایط گوناگونی همچون سواحل شنی (A.peregrina L.)، بیابانها (A.Violacea phil)، جلگه‌های آبرفتی (A.heamantha Ruiz)، دشتهای نیمه جنگلی (A.aurantiaca D.Don ) و مناطق سرد کوهستانی (A. Nivalis phil. In Lin) رشد و نمو کنند (هنس و ویلکینز، 1979 ). این گیاه دارای ریزوم‌های سفیدی می‌باشد که از آن شاخه‌های هوایی منشا می‌گیرند. شاخه‌ها بسته به دمای خاک، طول روز و شدت نور می‌توانند بصورت رویشی یا زایشی باشند (وانک نوردیروف، 1975؛ هیلی و همکاران، 1982).