پایان نامه ارشد صنایع : ارزیابی امکان استفاده از نشانگر مولکولی ISSR در بررسی تنوع … |
1-11- گیاهشناسی عدس …………………………………………………………………………………………… 19
1-12- ویژگی های اندام های رویشی و زایشی عدس …………………………………………. 20
1-12-1- ریشه ……………………………………………………………………………………………………………… 20
1-12-3- برگ ……………………………………………………………………………………………………………….. 21
1-12-4- گل …………………………………………………………………………………………………………………. 22
1-12-5- غلاف ……………………………………………………………………………………………………………… 22
1-12-6- بذر ………………………………………………………………………………………………………………….. 23
1-13- جوانه زنی …………………………………………………………………………………………………………… 23
1-14- سطح زیر کشت و عملکرد گیاه مورد بررسی …………………………………………… 23
فصل دوم: ی بر تحقیقات انجام شده
2-1- نشانگرها ………………………………………………………………………………………………………………… 25
2-2- انواع نشانگر …………………………………………………………………………………………………………… 25
2-2-1- نشانگر RAPD …………………………………………………………………………………………….. 25
2-2-2- نشانگر RFLP ………………………………………………………………………………………………. 27
2-2-3- نشانگر AFLP ………………………………………………………………………………………………. 28
2-2-4- نشانگر SSR ………………………………………………………………………………………………….. 30
2-2-4- نشانگر 31
2-2-4-2- نقشه یابی ژنوم ………………………………………………………………………………………….. 32
2-2-4-3- برچسب زنی ژن و گزینش به کمک مارکر ……………………………………….. 32
2-2-4-4- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی …………………………………………………………… 33
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1- تجهیزات و مواد موردنیاز جهت آزمون شیمیایی، میکروبی و PCR …….. 36
3-1-1- تجهیزات مورد استفاده ………………………………………………………………………………… 36
3-1-2- مواد مورد استفاده …………………………………………………………………………………………. 37
3-1-3- بافرها و محلول ها …………………………………………………………………………………………. 38
3-1-3-1- بافر TBE (TRIS-Boric acid- EDTA) ……………………………….. 38
3-1-3-2- محلول EDTA ………………………………………………………………………………………. 39
3-1-3-3- NaOH ……………………………………………………………………………………………………… 39
3-1-3-4- CTAB BUFFER…………………………………………………………………………….. 39
3-2- خصوصیات مکان آموزشی ……………………………………………………………………………….. 39
3-3- طرح آزمایشی و فاکتورهای مورد مطالعه …………………………………………………….. 40
3-4-1- مواد گیاهی ……………………………………………………………………………………………………… 40
3-4-2- استخراج DNA ژنومی گیاه ……………………………………………………………………… 41
3-4-2-1- استخراج DNA ژنومی به روش CTAB ……………………………………….. 41
3-4-2-2- نحوه تهیه ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………… 42
3-5- انجام واکنش PCR …………………………………………………………………………………………… 43
3-6- مواد لازم جهت انجام PCR ……………………………………………………………………………. 43
3-6-1- آغازگر ……………………………………………………………………………………………………………….. 43
3-6-2- آنزیم Taq DNA Polymerase …………………………………………………………. 44
3-7- تنظیم شرایط برای PCR ………………………………………………………………………………… 44
3-8- الکتروفورز و رنگ آمیزی محصول PCR …………………………………………………….. 46
3-9- تجزیه و تحلیل داده ها ……………………………………………………………………………………… 46
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1- جوانه زنی و سبز شدن گیاهان ……………………………………………………………………….. 4٧
4-2- کمیت و کیفیت DNA استخراجی ………………………………………………………………. 4٨
4-4- روابط فیلوژنتیک بین ژنوتیپ ها ……………………………………………………………………… ٤٩
فصل پنجم: نتیجه گیری
5-١- نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………. 5٢
5-٢- بحث ………………………………………………………………………………………………………………………. 5٣
5-٣- پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………. 5٤
منابع فارسی …………………………………………………………………………………………………………………….. 5٥
منابع انگلیسی ………………………………………………………………………………………………………………….. 6٣
چکیده انگلیسی 6٧
چکیده
حبوبات دانههای خوراکی هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند. حبوبات بعد از غلات مهمترین منبع غذایی بشر به حساب میآیند. عدس زراعی گیاهی از جنس Lens، گونه culinaris متعلق به تیره لگومینوزه، زیرخانواده پروانهآسا، از قبیله Vicieae میباشد. عملیات اصلاحی در عدس در مقایسه با سایر محصولات مهم زراعی از قدمت کمتری برخوردار است و فعالیت نسبتا جدیدی است. با توجه به این موضوع لزوم تعیین تنوع ژنتیكی در این گیاه از اهمیت ویژه ای برخوردار است و استفاده از روش های جدید ارزیابی تنوع ژنتیكی به منظور انتخاب والدین دو رگ و تعیین میزان قرابت ارقام ضروری می باشد. دراین ارتباط بهترین روش استفاده از نشانگرهای مولكولی می باشد، زیرا تعیین تنوع به وسیله نشانگرهای مورفولوژیكی با توجه به اثرات متقابل محیط و ژنوتیپ و فنوتیپ گیاهان، كارایی شاخص های مورفولوژیكی را كم می نماید. در این مطالعه به منظور بررسی تنوع ژنتیكی 18 توده عدس خراسان شمالی از نشانگر مولكولی ISSR كه مبتنی بر PCR است، استفاده شد. برای استخراج DNA از روش CTAB استفاده شد و تكثیر ژنوم نمونه ها با استفاده از 10 پرایمر اختصاصی ISSR انجام پذیرفت. سپس با الكتروفورز ژل آگارز و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید، قطعات تكثیر شده مورد ارزیابی قرار گرفتند که از مجموع 125 باند تولید شده 32 باند منومورف و 93 باند از آنها چند شکل بودند. درصد چند شکلی برای هر آغازگر از 5/28 درصد برای آغازگر E55تا 3/92 درصد برای آغازگر B22متغییر بود. در این بررسی توزیع مقادیر PIC بین 28/0 تا 49/0 با میانگین 45/0 متغییر بود. شاخص نشانگر در آغازگر های مورد مطالعه بین 9/7 تا 2/45 قرار داشت. بیشترین مقدار شاخص نشانگر متعلق به آغازگر B22 بود که نشان دهنده قدرت تفکیک بالاتر این آغازگر در مقایسه با سایر آغازگرها است. که با توجه به میزان محتوای اطلاعات چند شکلی آغازگرها وشاخص نشانگر، آغازگرهای B22 و RA3 و RR1 در بررسی تنوع ژنتیکی مناسب میباشند. میزان فاصله ژنتیکی ژنوتیپها با استفاده از روش UPGMA و در نرمافزار NTSYS محاسبه و ارتباط ژنوتیپها با استفاده از دندروگرام نشان داده شد. دندروگرام حاصل از تجزیه و تحلیل مجموع الگوهای باندی حاصل از پرایمرهای مورد استفاده، تودهها را در سطح 5/61 درصد به 4 گروه تقسیم نمود. با توجه به اهداف این تحقیق میتوان به این نتایج رسید که بررسی تنوع ژنتیکی تودههای عدس با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR امکان پذیر بوده و با استفاده از این نشانگر میتوان تودههای مورد بررسی را به گروههای مختلف تقسیمبندی کرد. همچنین به وسیله فاصله ژنتیکی به دست آمده بین تودهها، با توجه به درصد تشابه آنها میتوان تودهها با فاصله ژنتیکی بیشتر را جهت استفاده در مراکز تحقیقاتی جهت تولید بذور هیبرید با هتروزیس مطلوب استفاده نمود.
کلمات کلیدی: تنوع ژنتیکی، چندشکلی، عدس، نشانگر، ISSR
فصل اول : مقدمه
١-١-اهمیت و ضرورت انجام تحقیق
بقولات از متنوعترین تیرههای گیاهی جدا گلبرگ بوده که بعد از تیره کاسنی و ثعلب در رده نهاندانگان قرار دارند. این تیره مشتمل بر حدود ٧٥٠ جنس و ٢٠٠٠ گونه میباشد (هیکی و کینگ، ١٩٩٧). از ویژگیهای مشترک تیره بقولات میتوان به وجود تخمدان یک برچه و آزاد، که پس از رسیدن تشکیل میوهای بنام لگوم یا غلاف (نیام) را میدهد، اشاره کرد (مجنون حسینی، ١٣٨٧).
حبوبات دانههای خوراکی هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند (اسدیچالشتری و همکاران، ١٣٨٥). حبوبات بعد از غلات مهمترین منبع غذایی بشر به حساب میآید. پروتئین حبوبات در جوامع بشری به خصوص اقشار کم درآمد نقش مهمی در تغذیه ایفا میکند تا به آن حد که به گوشت فقرا معروف شده است (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥). گیاهان خانواده لگومینوزه، در دوران کرتاسه پیدا شدهاند و به شرایط مرطوب آن زمان، که مشابه شرایط گرم و مرطوب امروزی است، سازگار شدند. بطور کلی اکثر گیاهان خانواده لگومینوزه به مناطق گرم سازگار شدهاند. ولی یکی از زیرخانوادههای آن، یعنی پروانهآساها، دارای انعطاف زیادی بوده و به مناطق معتدل و سرد معتدله سازگار شدهاند (کوچکی، ١٣٨٨). این گیاهان منبع مهم ویتامینهایی مانند ریبوفلاوین، ویتامین ب و کاروتن میباشند و از لحاظ اسیدهای آمینه ضروری مخصوصا لیزین که کمبود آن در غلات وجود دارد غنی هستند (سینگ و همکاران، ١٩٨٢). طبق مطالعات انجام شده ترکیب مناسبی از پروتئین حبوبات با غلات میتواند سوء تغذیه و کمبود اسیدهای آمینه را برطرف کند. در کشورهای در حال توسعه تقریبا یک چهارم نیاز پروتئینی توسط حبوبات تامین میشود و عدس با دارا بودن حدود ٢٨ درصد نقش مهمی را در تغذیه مردم ایفا میکند (پارسا و همکاران، ١٣٨٤). در میان گیاهان مناطق خشک و نیمه خشک، عدس از جمله گیاهانی است که غالبا در اراضی حاشیهای و در خاکهای نه چندان حاصلخیز کشت میشود. این گیاه همچنین قادر است که از طریق تثبیت نیتروژن موجب بهبود حاصلخیزی خاک شود (استاویر و همکاران، ٢٠٠٣). مهمترین قاره تولید کننده عدس آسیاست که ٦٨ درصد کل تولید جهان را در اختیار دارد (توکلی، ١٣٨٢). معمولا گونههای عدس را به دو گروه اصلی تقسیم میکنند (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥) :
١-میکرواسپرما : با بذرهای ریز گرد به قطر ٢ تا ٦ میلیمتر که رنگ پوسته بذر آن از زرد کمرنگ تا سیاه متغیر است.
٢-ماکرواسپرما : در این گروه بذرهای بزرگتر و پهنتر هستند و رنگ پوسته بذر سبز کمرنگ است. این گروه از گیاهان دارای غلافها و برگچههای بزرگتری نسبت به گروه قبلی هستند. بطور کلی گیاهان میکرواسپرما قدیمیتر بوده و گیاهان ماکرواسپرما از میان آنها انتخاب شدهاند.
عدس نسبت به سایر حبوبات دارای مدت پخت کوتاهتری است و راحتتر هضم میگردد (وب و هوتین، ١٣٧٦). عدس در رفع یبوست و اختلالات رودهای مفید است، همچنین در جلوگیری از سکته نیزموثر میباشد. مرهم خمیر عدس جهت التیام زخمهای باقی مانده از آبله در طب سنتی توصیه شده است (مجنون حسینی، ١٣٨٧). مقدار پروتئین عدس با باقلا برابر و از نخود بیشتر است. عدس سرشار از آهن است و همچون باقلا و نخود منبع خوبی برای تیامین و نیاسین بوده، اما از نظر ویتامین B و کاروتن نسبتا فقیر است (نامدار و همکاران، ١٣٧٤). اگرچه عدس اساسا در تغذیه انسان استفاده میشود ولی از آن در تغذیه حیوانات به ویژه ماکیان نیز استفاده میگردد. کاه و دیوارههای غلاف و بقایای ناشی از کوبیدن آن از ارزش تغذیهای زیادی برای دام برخوردارند (وب و هوتین، ١٣٧٦).
عدس یکی از قدیمیترین گیاهان زراعی است که منشاء آن خاکهای حاصلخیز خاور نزدیک میباشد. قدمت این گیاه به شروع کشاورزی باز میگردد. در مقبره فراعنه مصر آثار خمیری محتوی عدس پخته بدست آمده است. نویسندگان یونانی در آثار خود به نام عدس اشاره داشتهاند و به نظر میرسد که این گیاه به عنوان هدیهای برای خدایان مورد استفاده قرار میگرفته است. رومیان نیز ارزش زیادی برای عدس قائل بودهاند بهطوری که آن را از مصر وارد میکردهاند (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥). نام عدس در کتابهای مقدس دینی نظیر انجیل و قرآن ذکر شده است. در قرآن (سوره بقره) عدس یکی از محصولات زمینی بوده
که یهودیان از موسی(ع) خواستند که از خداوند برایشان درخواست نماید (وب و هوتین، ١٣٧٦). یکی از قدیمیترین آثار گیاهان خوراکی بقایای عدس است که مربوط به ٧٥٠٠ تا ٨٥٠٠ سال قبل از میلاد مسیح میباشد (پارسا و باقری، ١٣٨٧).
به نظر میرسد که عدس در منطقهای بین جنوبغربی ترکیه و ترکمنستان از نژادهای وحشی خود اهلی شده است و به سمت نیل، یونان، اروپای مرکزی و متعاقب آن به سمت دانوب گسترش یافته باشد. بر اساس نظریههای موجود عدس به دلیل نیازهای متفاوت اکولوژیکی موجود در گونههای وحشی، پراکنش متفاوتی داشته و به مناطقی با شرایط مدیترانهای و همچنین در نواحی کوهپایهای جنوبغربی آسیا سازگار شده است (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥).
اصلاح کنندگان نباتات که در جهت دستیابی به تنوع ژنتیکی موجود در کلکسیون ژرمپلاسم فعالیت میکنند، نیاز به داشتن اطلاعاتی در مورد میزان تنوع دارند. عملیات اصلاحی در عدس در مقایسه با سایر محصولات مهم زراعی از قدمت کمتری برخوردار است و فعالیت نسبتا جدیدی است. بهبود در عدس عمدتا بر اساس معرفی مواد انتخاب شده برای سازگاری به نواحی خاصی بوده است. در نتیجه بیشتر ارقام مورد استفاده امروزی بر اثر انتخاب در جمعیتهای نامتجانس بدست آمده و از عملیات هیبریداسیون استفاده نشده است. پیشرفت با استفاده از این روش محدود به تنوع موجود در این تودهها و پیشرفتهای اصلاحی بعدی بستگی به هیبریداسیون و انتخاب خواهد داشت. کلکسیونهایی برای حفاظت از ژرمپلاسم عدس در آمریکا، هندوستان و سوریه ایجاد شده و از این نظر که تنوع ژنتیکی مورد نیاز برنامههای اصلاحی هیبریداسیون را فراهم میکند ارزشمند است.
با استفاده از روشهای انتخاب تودهای والدین خالص در داخل ژرمپلاسم یا نژادهای بومی میتوان به سهولت و سرعت به پیشرفتهای قابل توجهی دست یافت. این روشها میتوانند در کوتاه مدت نیاز به واریتههای اصلاح شده و همچنین مواد ژنتیکی یکنواخت مورد نیاز در برنامههای هیبریداسیون را فراهم کنند.
انتخاب تودهای دو نوع گزینش را دربر میگیرد :
١-حذف تیپهای نامطلوب از یک مخلوط یا جمعیتهای متنوع و برداشت گیاهان باقیمانده به صورت مخلوط.
٢-شناسایی تیپهای برتر در جمعیت از طریق علامتگذاری و یا هر روش دیگر و برداشت آنها به صورت مخلوط، نتیجه نهایی این دو روش کاهش فراوانی ژنوتیپهای نامطلوب و افزایش فراوانی ژنوتیپهای مطلوب خواهد بود.
انتخاب تودهای ممکن است در هر نوع از منبع ژنتیکی (مثل نژادهای بومی، جمعیتهای هیبرید) که دارای تغییرات ژنتیکی کافی باشد و موفقیت را تضمین کند انجام شود (وب و هوتین، ١٣٧٦).
از آنجا که تنوع، اساس هر برنامه اصلاحی است، به طوری که موفقیت یک برنامه اصلاحی به طبیعت و یا حجم و تنوع موجود در مواد ژنتیکی بستگی دارد. وجود حداکثر تنوع، بزرگترین شانس برای نائل شدن به موفقیت در گزینش محسوب میشود (میشرا و همکاران، ٢٠٠٧). با توجه به این که ایران یکی از مراکز تنوع عدس در جهان بوده و حتی پراکندگی دو گونه وحشی آن (Lens cyanea و Lens orientalis) نیز گزارش شده است (آقایی و همکاران، ١٣٨٣)، انتظار میرود تنوع زیادی در میان تودههای بومی این محصول یافت شود. تنوع ژنتیکی بین و داخل جمعیتهای گونههای گیاهی، یکی از موارد اصلی مورد مطالعه بهنژادگران و متخصصان ژنتیک میباشد (هایوارد و بریز، ١٩٩٣). مور و کولینز دریافتند که توجه به ژرمپلاسم گیاهان در طول نگهداری آنها، جهت پیشبینی پتانسیل ژنتیکی و استفاده از آن در برنامههای اصلاحی ضرووری است (مور و کولینز، ١٩٩٣). در استان خراسان شمالی عدس با سطح کشت ٢١٣١٢ هکتار که ٢٠٩٠٠ هکتار آن دیم میباشد و با مقدار تولید ٨٣٦٣ تن بیشترین تولید و سطح کشت در بین سایر حبوبات را به خود اختصاص داده است که این مطلب خود بیان کننده جایگاه ویژه این محصول در استان میباشد. با توجه به اهمیت گیاه عدس، انجام اقدامات اصلاحی در آن امری بسیار مهم میباشد.
فرم در حال بارگذاری ...
[چهارشنبه 1399-10-10] [ 10:29:00 ب.ظ ]
|