بر مطالعات گذشته. 1

 

1-1 سلول­های بنیادی جنینی.. 3

 

1-2 سلول­های بنیادی بالغ. 4

 

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان. 5

 

1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

 

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

 

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 10

 

1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 14

 

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها 17

 

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک… 17

 

1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک… 18

 

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20

 

و اتصال نوروتروفین.. 20

 

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین.. 22

 

1-6 سلول­های بنیادی عصبی.. 25

 

1-6-1 نوروسفر. 25

 

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31

 

1-7 ضرورت اهداف تحقیق.. 33

 

. 35

 

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36

 

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ. 36

 

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت    a-MEM.. 36

 

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH) 37

 

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA. 37

 

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان. 39

 

2-2-5 پاساژ سلولی.. 39

 

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی.. 39

 

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71. 40

 

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%. 41

 

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد. 41

 

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%. 41

 

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH). 42

 

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول.. 42

 

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز 43

 

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی.. 44

 

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی.. 45

 

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین.. 46

 

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده 46

 

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 48

 

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز 49

 

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-) 52

 

2-6-5 انتخاب پرایمر. 53

 

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها 54

 

2-6-7 واكنش PCR. 54

 

2-7 آنالیز آماری.. 58

 

… 59

 

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59

 

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز. 60

 

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت.. 60

 

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی.. 60

 

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین.. 61

 

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن 61

 

70

 

 

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها 71

 

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 72

 

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی.. 74

 

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت.. 76

 

4-5 نتیجه گیری.. 77

 

پیشنهادات.. 77

 

مراجع   79

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل­ها

 

 

 

تنظیم می­شود.. 22

 

P75NTR. 23

 

شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trk تنظیم می­شود. 24

 

شکل 1-4. سلول­های بنیادی عصبی و رده­های سلولی مربوط به آن.. 25

 

 شکل 1-5 .ارزیابی شکل­گیری نوروسفر. 26

 

 شكل 1. تصاویر فاز كنتراست سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی در محیط كشت در پاساژهای مختلف. 62

 

 شكل 2. شناسایی سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی.. 63

 

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته   64

 

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم  MSCs پس از هفته سوم. 65

 

شکل4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی  66

 

 شکل 5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین  66

 

شكل6 A.الگوی بیان ژن­ فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و B: گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67

 

شكل 6. C الگوی بیان ژن پیش­ساز عصبی و ژن­های اختصاصی سلول­های دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت).    67

 

 نمودار 6 A.  مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.. 68

 

 نمودار6  B.مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول­ها

 

 

 

جدول1-1 . اسامی گوناگون سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 6

 

جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرایمرها، F : پرایمر بالادست ، R : پرایمر پایین‌دست.. 57

 

 

 

مقدمه

 

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

 

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

 

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

 

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

 

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

 

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

 

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

 

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یك منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.