1-11-3) طبقه بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………………………………………………………..17

 

1-12) مواردکاربرد آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………………………………………24

 

1-13) ماکرولیدها…………………………………………………………………………………………………………………………………………..27

 

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………………………………………………………30

 

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………………..31

 

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..32

 

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………32

 

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………33

 

1-19) فارماکوکینتیک…………………………………………………………………………………………………………………………………..34

 

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………34

 

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………35

 

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………36

 

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین………………………………………………………………………………..36

 

1-24) مراحل کلیدی فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……………………………………………….38

 

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………………………………………………………39

 

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن………………………………………………………….44

 

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding ………………………………………………………………………………..45

 

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation ………………………………………………………………………………………………47

 

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………………………….48

 

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک…………………………………………………………………………………………………………….48

 

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار………………………………………………………………………………………………………….49

 

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……50

 

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………………………………….50

 

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی……………………………………………………………………………………………………………………..51

 

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی………………………………………………………………………………………………………………….55

 

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………………………………………………………….57

 

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………………………………………………………….57

 

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده…………………………………………………………………………………………………………..59

 

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد………………………………………………………………………………………….61

 

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها…………………………………………………………………………………………………………………….61

 

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها…………………………………………………………………………………….61

 

1-24-4-2-2) تأثیر pH………………………………………………………………………………………………………………………………62

 

1-24-4-2-3) تأثیر دما………………………………………………………………………………………………………………………………..64

 

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی…………………………………………………………………………………………………………………………67

 

1-24-4-2-5) تأثیر هم زدن………………………………………………………………………………………………………………………..68

 

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن…………………………………………………………………………………………………………..71

 

1-24-4-2-7) تأثیر کف……………………………………………………………………………………………………………………………….71

 

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………………………………………………………..73

 

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته……………………………………………………………………………………………………………………74

 

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………………………………………………….76

 

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول…………………………………………………………………………………………………..77

 

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………………………..79

 

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن……………………………………………………………………………………………..79

 

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………80

 

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا……………………………………………………………………………………………………………81

 

1-25-4) سویا در ایران………………………………………………………………………………………………………………………………….82

 

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا……………………………………………………………………………………………………………………….82

 

1-25-6) کنجاله سویا……………………………………………………………………………………………………………………………………83

 

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………………………….83

 

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………………………………………………….84

 

1-26-2) تاریخچه کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………………..85

 

1-26-3) تولید جهانی کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………….86

 

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………86

 

 

فصل دوم : بر متون گذشته

 

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………………………..88

 

فصل سوم : مواد و روش ها

 

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش……………………………………………………………………………………………..93

 

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش………………………………………………………………………………………………..93

 

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………….94

 

3-4) محیط های کشت مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………………95

 

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………………………………………………………95

 

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………………………………………….98

 

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)……………………………………………………………99

 

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………………………………………………….100

 

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر…………………………………………………………………………………………………………….104

 

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر………………… ……..105

 

3-5) نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………….106

 

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده……………………………………………………………………………………………………….106

 

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 ………………………………………………………………………………………107

 

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 ……………………………………..108

 

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4…………………………………………………………………………………………..108

 

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو……………………………………………………………………………………………………………….108

 

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین……………………………………………………………………………………..109

 

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با استفاده از کلروفرم…………………………………………………………111

 

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو…………………………………………………………………..112

 

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………………..113

 

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………………………….113

 

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار………………………………………………………………………………………………………113

 

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث……………………………………………………………………………………………………..114

 

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………..114

 

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………………………………..114

 

3-7-5) تهیه مایع تلقیح………………………………………………………………………………………………………………………………115

 

3-7-6) تهیه چاهک…………………………………………………………………………………………………………………………………….116

 

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8………………………………………………………………………………………………………………116

 

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………………………………….116

 

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها……………………………………………………………………………….117

 

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد…………………………………………………………………………………………………..117

 

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………………………………………………………….117

 

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا…………………………………………..118

 

3-8-1) فاز متحرک……………………………………………………………………………………………………………………………………..118

 

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………………………………………………………118

 

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین……………………………………………………………………………………………………..119

 

3-9) کروماتوگرافی لایه نازک TLC …………………………………………………………………………………………………………119

 

فصل چهارم: نتایج پژوهش

 

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین ( محیط شاهد )…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..123

 

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………………………………….123

 

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)…………………………………………………………………..124

 

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………………………………………125

 

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل)…..125

 

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین……………………………………………….128

 

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………………………………..129

 

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی…………………………………………………130

 

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی…………………………….130

 

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………..131

 

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر……………………………………………………………………………………………………132

 

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین…………………………………………………………………..132

 

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر…………………………………………………………….133

 

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی…………………………………………………………………133

 

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea…………………134

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…..137

 

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…………………………………………………………………………………..137

 

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………………………………………..138

 

5-2) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین……………………………….144

 

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرآیند…………………………………………………….145

 

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی………………………………………………………………………………………………………………….146

 

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر………………………..148

 

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین…………………………………………………………………….149

 

5-6) برآورد هزینه ها……………………………………………………………………………………………………………………………………153

 

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..153

 

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر…………………………………………154

 

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا……………………..154

 

5-7) پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………..156

 

 

 

منابع و مراجع…………………………………………………………………………………………………………………..158

 

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………….165

 

ضمائم …………………………………………………………………………………………………………………………….166

 

 

 

 

 

 

 

عنوان                                      فهرست جداول                                      صفحه

 

(جدول 1-1) گروه های میکروبی تولید کننده آنتی بیوتیک………………………………………………………………………..14

 

(جدول 1-2) برخی آنتی بیوتیک های مهم و مکانیسم عمل آنها………………………………………………………………..23

 

(جدول 1-3) مواد معدنی به کار رفته در محیط کشت…………………………………………………………………………………60

 

(جدول 1-4) محدوده دمایی رشد میکروارگانیسم های مختلف…………………………………………………………………..64

 

(جدول 1-5) تأثیر دی اکسید کربن بر تولید سیزومیسین در طی فرآیند تخمیر……………………………………….71

 

(جدول 3-1) محیط کشت اسپورزایی ISP medium 2…………………………………………………………………………..95

 

(جدول 3-2) محیط کشت اسپورزایی CSL ……………………………………………………………………………………………….96

 

(جدول3-3) ترکیبات محلول میکروالمنت…………………………………………………………………………………………………….96

 

(جدول3-4) ترکیبات محیط کشت بذردهی……………………………………………………………………………………………….99

 

(جدول3-5) ترکیبات محیط کشت تخمیر………………………………………………………………………………………………….104

 

(جدول3-6) مقادیر کنجاله سویا و کنجاله کلزا در محیط های تخمیر………………………………………………………106

 

(جدول3-7) محلول های نهایی اریترومایسین استاندارد…………………………………………………………………………….111

 

(جدول5-1) آنالیز ترکیبی کنجاله سویا افزوده شده به محیط کشت تخمیردر این پژوهش……………………139

 

(جدول5-2) آنالیز ترکیبی کنجاله کلزای افزوده شده به محیط کشت تخمیردر این پژوهش………………….140

 

(جدول5-3) اسیدآمینه های ضروری کنجاله سویا استفاده شده در این پژوهش……………………………………..140

 

(جدول5-4) اسیدآمینه های غیر ضروری کنجاله سویا استفاده شده در این پژوهش………………………………141

 

(جدول5-5) اسیدآمینه های ضروری کنجاله کلزا استفاده شده در این پژوهش……………………………………….141

 

(جدول5-6) اسیدآمینه های غیر ضروری کنجاله کلزا استفاده شده در این پژوهش………………………………..142

 

 

 

 

 

عنوان                                     فهرست نمودارها                                     صفحه

 

(نمودار 4-1) تغییرات pH در طول فرآیند تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت کنترل…………………………..123

 

(نمودار 4-2) تغییرات درصد بیومس در طول فرآیند تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت کنترل ( منحنی رشد باکتری )………………………………………………………………………………………………………………………………………………..124

 

( نمودار 4-3) میزان تولید اریترومایسین در محیط کشت کنترل……………………………………………………………..125

 

(نمودار 4-4) اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا روی pH محیط کشت در روزهای نمونه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………129

 

(نمودار 4-5) تغییرات درصد وزن تر بیومس تولیدی در محیط کشت تخمیر در روزهای مختلف و تمامی غلظت ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..130

 

(نمودار 4-6) تغییرات غلظت تولیدی اریترومایسین در محیط کشت تخمیر در روزهای مختلف و تمامی غلظت ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..131

 

(نمودار 4-7) تولید اریترومایسین در طول فرآیند در محیط کشت حاوی غلظت بهینه……………………………132

 

(نمودار 4-8) تغییرات pH درطی فرآیند تولید اریترومایسین در محیط کشت تخمیر حاوی غلظت بهینه……….133

 

(نمودار4-9) تغییرات درصد وزن تر بیومس تولیدی درطی فرآیند تولید اریترومایسین در محیط کشت تخمیر حاوی غلظت بهینه……………………………………………………………………………………………………………………………134

 

 

 

 

 

 

 

عنوان                                      فهرست اشکال                                      صفحه

 

(شکل1-1) اریترومایسین و الئاندومایسین، نمونه ای از ماکرولیدهای 14 عضوی……………………………………….27

 

(شکل1-2) مسیر کلی بیوسنتز اریترومایسین……………………………………………………………………………………………….29

 

(شکل1-3) ساختار شیمیایی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………….31

 

(شکل1-4) نمونه ای از یک فرمانتور همزن دار…………………………………………………………………………………………….50

 

(شکل1-5) شمایی از یک راکتور مجهز به همزن………………………………………………………………………………………….69

 

(شکل1-6) یک دستگاه تخمیر مجهز به سیستم تزریق هوا…………………………………………………………………………70

 

(شکل1-7) نمونه ای از کف شکن های مکانیکی………………………………………………………………………………………….72

 

(شکل1-8) کشتزار کلزا در کلاله ایران…………………………………………………………………………………………………………86

 

(شکل 3-1) تصویری از آمپول لیوفیلیزه حاوی سویه باکتری Saccharopolyspora erythraea ….93

 

(شکل3-2) تصویری از اسپورهای تشکیل شده بر روی محیط اسپورزایی CSL در روز 10 …………………….98

 

(شکل3-3) تصویری از واکنش رنگی اریترومایسین تولیدی و محلول بروموفنل بلو………………………………….112

 

(شکل 3-4) کروماتوگرافی لایه نازک…………………………………………………………………………………………………………..120

 

(شکل3-5) کروماتوگرافی لایه نازک…………………………………………………………………………………………………………..121

 

(شکل4-1) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز چهارم تخمیر……..126

 

(شکل4-2) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز ششم تخمیر……….126

 

(شکل 4-3) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز هشتم تخمیر…….127

 

(شکل4-4) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز دهم تخمیر………..127

 

(شکل 4-5) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز یازدهم تخمیر…..128

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

چکیده

 

امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر  نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و  پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ای Saccharopolyspora erythraea   استفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 44 ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه 8/6 در شیکر انکوباتوردار با دمای 33 درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت 11 روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :