فصل دوم: ی بر تحقیقات گذشته

 

 

 

٢ـ١ـ اشریشیا کلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC)

 

 

4

 

 

 

٢ـ٢ـ   فاکتور های بیماری زای تولید شده توسط UPEC

 

 

5

 

 

 

٢ـ٢ـ١ـ   ادهسین ها و فاکتور های موثر در کلونیزاسیون

 

 

5

 

 

 

١_٢_٢_١_   پیلی یا فیمبریه (Fimbriae)

 

 

5

 

 

 

٢_٢_٢_١_ فیمبریه نوع

 

 

6

 

 

 

٣_٢_٢_١_ فیمبریه P  

 

 

7

 

 

 

٤_٢_٢_١_ فیمبریه S  

 

 

8

 

 

 

٥_٢_٢_١_   تاژک و تحرک

 

 

9

 

 

 

٦_٢_٢_١_   Curli

 

 

10

 

 

 

٧_٢_٢_١_  پیلی F جنسی

 

 

11

 

 

 

٢ـ٢ـ٢ـ توکسین ها

 

 

11

 

 

 

١_٢_٢_٢_ آلفا همولیزین

 

 

12

 

 

 

٢_٢_٢_٢_ فاکتور نکروز دهنده سیتوتوکسیک (CNF_1)

 

 

12

 

 

 

٢ـ٢ـ٣ـ   بقاء و فرار از سیستم ایمنی

 

 

12

 

 

 

١_٢_٢_٣_ سیدروفور ها (آئروباکتین)

 

 

 

12

 

 

 

٢_٢_٢_٣_ کپسول پلی ساکاریدی

 

 

13

 

 

 

٣_٢_٢_٣_ تشکیل بیوفیلم

 

 

14

 

 

 

٢ـ٣ـ   عفونت های مجاری ادراری( Urinary Tract Infection; UTI)

 

 

14

 

 

 

٢ـ٣ـ١ـ نقش پیلی در عفونت های مجاری ادراری

 

 

16

 

 

 

٢ـ٤ـ بیوفیلم ها

 

 

17

 

 

 

٢ـ٤ـ١ـ توسعه بیوفیلم

 

 

18

 

 

 

٢ـ٤ـ٢ـ مقاومت آنتی بیوتیکی در بیوفیلم ها

 

 

20

 

 

 

٢ـ٤ـ٣ـ بررسی ارتباط بین تشکیل بیوفیلم، فاکتورهای یوروویرولان و مقاومت ضد میکروبی

 

 

22

 

 

 

٢ـ٥ـ نقش آب گریزی (Hydrophobicity) در اتصال باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن

 

 

23

 

 

 

فصل سوم : مواد و روش ها

 

 

 

٣ـ١ـ   مواد و وسایل

 

 

24

 

 

 

٣ـ١ـ١ـ محیط های کشت استفاده شده

 

 

24

 

 

 

٣ـ١ـ٢ـ مواد شیمیایی

 

 

24

 

 

 

٣ـ١ـ٣ـ کیت ها

 

 

24

 

 

 

٣ـ١ـ٤ـ دستگاه ها

 

 

24

 

 

 

٣ـ٢ـ   جمع آوری نمونه ها

 

 

25

 

 

 

٣ـ٣ـ جداسازی و خالص سازی

 

 

25

 

 

 

٣ـ٤ـ مشاهده میکروسکوپی

 

 

25

 

 

 

٣ـ٥ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتریUPEC

 

 

26

 

 

 

٣ـ٦ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

 

 

26

 

 

 

٣ـ٧ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با استفاده از هیدروکربن اکتان

 

 

26

 

 

 

٣ـ٨ـ استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت سینا ژن

 

 

28

 

 

 

٣ـ٩ـ تعیین کیفیت DNA با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز

 

 

28

 

 

 

٣ـ١٠ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

 

 

29

 

 

 

٣_١١_ الکتروفورز ژل آگارز

 

 

31

 

 

 

فصل چهارم: نتایج

 

 

 

٤ـ١ـ آزمایشات تشخیصی برای تعیین اشریشیا کلی یوروپاتوژن (UPEC)

 

 

33

 

 

 

٤ـ٢ـ فراوانی باکتریهای بیماریزای جدا شده از ادرار

 

 

34

 

 

 

٤ـ٣ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC

 

 

34

 

 

 

٤ـ٤ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

 

 

36

 

 

 

٤ـ٥ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با استفاده از هیدروکربن اکتان

 

 

38

 

 

 

٤ـ٦ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

 

 

40

 

 

 

 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

 

 

٥ـ١ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC

 

 

52

 

 

 

٥ـ٢ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

 

 

44

 

 

 

٥ـ٣ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با استفاده از هیدروکربن اکتان

 

 

45

 

 

 

٥ـ٤ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

 

 

46

 

 

 

نتیجه گیری

 

 

48

 

 

 

پیشنهادات

 

 

49

 

 

 

منابع و مآخذ

 

 

50

 

 

 

چکیده انگلیسی

 

 

57

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها
عنوان	صفحه
شکل ١_١_ تفاوت Pili و Curli	11
شکل ١_٢_ کپسول پلی ساکاریدی	13
شکل١_٣_ مراحل توسعه یافتگی بیوفیلم	19
شکل٤_١_ کلنی ها با جلای فلزی UPEC	34
شکل ٤_٢_ باسیل های گرم منفی UPEC	34
شکل ٤_٣_ محیط های افتراقی جهت بررسی E.coli جدا شده از ادرار	34
شکل ٤_٤_ هاله عدم رشد UPEC در حضور آنتی بیوتیک ها	36
شکل ٤_٥_ تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت با استفاده از روش اتصال به کریستال ویوله (CV)	37
شکل ٤_٦_ بررسی هیدروفوبیسیتی(قدرت اتصال) UPEC با استفاده از هیدروکربن اکتان	39
شکل ٤_٧_ نتایج الکتروفورز محصولPCR جهت شناسایی­ژن هایpap (328 bp) و sfa (410 bp	41

 

  چکیده

 

عفونت دستگاه ادراری یکی از شایعترین عفونت های بیمارستانی است که از کلونیزه شدن اشرشیا کلی یوروپاتوژن در اپیتلیوم مخاطی میزبان ناشی می شود و به بافت میزبان آسیب می رساند. ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی یوروپاتوژن دخیل هستند. از جمله فاکتورهای سطحی در اتصال باکتری و تشکیل بیوفیلم، پیلی P و S می باشد. هدف از این مطالعه تعیین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی ، بررسی تشکیل بیوفیلم اشریشیا کلی یوروپاتوژن، سنجش قدرت اتصالی یا خاصیت هیدروفوبیسیتی آن و بررسی وجود ژن های فیمبریه ای pap وsfa و ارتباط آنها در تشکیل بیوفیلم بود.

 

در این تحقیق تعداد 100 نمونه از کشت باکتری بیماران مشکوک به عفونت دستگاه ادراری (UTI) جمع آوری گردید. با استفاده از تست های بیوشیمیایی متداول E.coli بودن 70 نمونه تایید گردید. مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن با استفاده از روش Kirby – Bauer مورد بررسی قرار گرفت. تشکیل بیوفیلم این باکتری با روش میکروتیترپلیت بررسی شد. به منظور بررسی اتصال باکتری و میزان هیدروفوبیسیتی ، روش هیدروکربن اکتان استفاده شد. پس از استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج، حضور ژن های pap و sfa به روش Multiplex PCR مورد بررسی گرفت.

 

از مجموع 100 نمونه مورد بررسی به کمک روش های بیوشیمیایی متداول 70 نمونه به عنوان اشریشیا کلی یوروپاتوژن شناسایی شدند. نتایج نشان دادن که این باکتری با هیدروفوبیسیتی 23% توانایی تشکیل بیوفیلم را دارد. از نظرمیزان تشکیل بیوفیلم 86% قدرت بسیار کم، ٨/٢ ٪ قدرت متوسط و ٢/١١٪ دارای قدرت بسیار بالا نشان دادند. همچنین بر اساس نتایج بدست آمده از آزمایش Multiplex PCR بر روی 10 نمونه ای که بالاترین قدرت تشکیل بیوفیلم را داشتند، 10نمونه (100٪) واجد ژن pap، 7 نمونه (70٪) واجد ژن sfa و 7 نمونه (70٪) نیز به طور همزمان دارای ژن pap و sfa بودند.