2

 

 

1-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

4

 

 

1-1-1 اهمیت موضوع…………………………………………………………………………………………………

 

 

 

4

 

 

1-1-2 فرضیات………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

5

 

 

1-1-3 اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………………

 

 

 

5

 

 

1-1-4 ساختارپژوهش…………………………………………………………………………………………………

 

 

 

6

 

 

1-2 کلیات………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

6

 

 

1-2-1 گیاه شناسی……………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

7

 

 

1-2-2 رویش و تکثیر گیاه…………………………………………………………………………………………..

 

 

 

7

 

 

1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار…………………………………………………………………………………….

 

 

 

7

 

 

1-2-4 نیازهای اکولوژی………………………………………………………………………………………………

 

 

 

8

 

 

1-2-5 اهمیت دارویی…………………………………………………………………………………………………

 

 

 

8

 

 

1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس…………………………………………………………………………………

 

 

 

9

 

 

1-2-7 استفاده‌ها…………………………………………………………………………………………………………

 

 

 

9

 

 

1-2-8 کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………

 

 

 

11

 

 

1-2-8-1 تاریخچه کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………..

 

 

 

 

12

 

 

1-2-9 کاربردهای کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………….

 

 

 

12

 

 

1-2-9-1 تولید مواد شیمیایی……………………………………………………………………………………….

 

 

 

12

 

 

1-2-9-2 ایجاد گیاه عاری از عوامل بیماری‌زای گیاهی……………………………………………………

 

 

 

12

 

 

1-2-9-3 ایجاد تنوع ژنتیکی………………………………………………………………………………………..

 

 

 

12

 

 

1-2-9-4 کاربرد کشت بافت گیاهی در کشاورزی،باغبانی و جنگل‌داری…………………………….

 

 

 

13

 

 

1-2-9-5 کاربردهای اقتصادی کشت بافت گیاهی…………………………………………………………..

 

 

 

13

 

 

1-2-9-6 کاربردهای کشت بافت گیاهی در مهندسی ژنتیک و فناوری زیستی…………………….

 

 

 

صفحه

 

 

عنوان

 

 

 

14

 

 

1-2-9-7 انواع کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………………..

 

 

 

14

 

 

1-2-9-8 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت…………………………………………….

 

 

 

15

 

 

1-2-9-9 نمک‌های غیرآلی………………………………………………………………………………………….

 

 

 

15

 

 

1-2-9-10 ویتامین‌ها…………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

16

 

 

1-2-9-11 هورمون‌های گیاهی…………………………………………………………………………………….

 

 

 

16

 

 

1-2-9-11-1 اکسین‌ها………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

17

 

 

1-2-9-11-2 سیتوکنین‌ها……………………………………………………………………………………………

 

 

 

18

 

 

1-2-9-12 منبع انرژی…………………………………………………………………………………………………

 

 

 

18

 

 

1-2-9-13 عوامل فیزیکی……………………………………………………………………………………………

 

 

 

18

 

 

1-2-9-14 مواد آلی…………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

19

 

 

1-2-9-15 ریزنمونه……………………………………………………………………………………………………

 

 

 

19

 

 

1-2-9-16 PH………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

19

 

 

1-2-9-17 آب…………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

20

 

 

1-2-9-18 آگار………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

20

 

 

1-2-9-19 چگونگی انتخاب محیط کشت……………………………………………………………………..

 

 

 

20

 

 

1-2-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت…………………………………………………………….

 

 

 

21

 

 

1-2-10-1 موارد استفاده از ریزازدیادی…………………………………………………………………………

 

 

 

22

 

 

1-2-11ریشه‌زائی………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

22

 

 

1-2-12 تعریف موتاسیون (جهش)……………………………………………………………………………….

 

 

 

22

 

 

1-2-12-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون……………………………………………………………………….

 

 

 

23

 

 

1-2-12-2 انواع موتاسیون…………………………………………………………………………………………..

 

 

 

23

 

 

1-2-12-3 موتاژن………………………………………………………………………………………………………

 

 

 

24

 

 

1-2-12-3-1 انواع موتاژن…………………………………………………………………………………………..

 

 

 

24

 

 

1-2-12-3-2 عوامل شیمیایی جهش‌زا…………………………………………………………………………..

 

 

 

25

 

 

1-2-12-4 سطوح ایجاد موتاسیون………………………………………………………………………………..

 

 

 

صفحه

 

 

عنوان

 

 

 

26

 

 

1-2-12-5 مواد گیاهی مورد تیمار………………………………………………………………………………..

 

 

 

26

 

 

1-2-12-6 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات……………………………………………………………….

 

 

 

26

 

 

1-2-12-7 هدف موتاسیون مصنوعی…………………………………………………………………………….

 

 

 

27

 

 

1-2-12-8 موفقیت موتاسیون………………………………………………………………………………………

 

 

 

27

 

 

1-2-12-9 اصلاح به روش موتاسیون……………………………………………………………………………

 

 

 

27

 

 

1-2-12-10 روش‌های جدید استفاده از موتاسیون………………………………………………………….

 

 

 

28

 

 

1-2- 13اسانس گیاهی…………………………………………………………………………………………………

 

 

 

29

 

 

1-2-13-1روغن‌های اسانس………………………………………………………………………………………..

 

 

 

30

 

 

1-2-13-2 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه……………………………

 

 

 

 

 

 

          فصل دوم: ی بر تحقیقات انجام شده

 

 

 

31

 

 

2-1 اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف………………………………………………………….

 

 

 

33

 

 

2-2 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف……………………………..

 

 

 

38

 

 

2-3 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

 

 

 

          فصل سوم: مواد و روش‌ها

 

 

 

40

 

 

3-1 مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

40

 

 

3-2 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

40

 

 

3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت……………………………………………………………………

 

 

 

41

 

 

3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو……………………………………………………………………………….

 

 

 

41

 

 

3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو…………………………………………………………………….

 

 

 

43

 

 

3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم……………………………………………………………………….

 

 

 

43

 

 

3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین…………………………………………………………………………….

 

 

 

44

 

 

3-2-2 تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………

 

 

 

45

 

 

3-2-3 کار در اتاقک کشت بافت…………………………………………………………………………………..

 

 

 

46

 

 

3-2-4 ضدعفونی وسایل آزمایشگاهی، محیط کشت و مواد گیاهی……………………………………

 

 

 

46

 

 

3-2-4-1 ضدعفونی نمونه‌های گیاهی……………………………………………………………………………

 

 

 

صفحه

 

 

عنوان

 

 

 

46

 

 

3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه……………………………………………………………………………………..

 

 

 

47

 

 

3-2-5 تهیه ریزنمونه……………………………………………………………………………………………………

 

 

 

47

 

 

3-2-6 بهینه سازی محیط کشت……………………………………………………………………………………

 

 

 

47

 

 

3-2-7 بررسی نمونه‌های کشت شده…………………………………………………………………………….

 

 

 

47

 

 

3-2-8 بازیافت کشت‌های آلوده……………………………………………………………………………………

 

 

 

48

 

 

3-2-9 تیمارهای مورد استفاده………………………………………………………………………………………

 

 

 

48

 

 

3-2-9-1 روش تهیه استوک EMS …………………………………………………………………………….

 

 

 

49

 

 

3-2-9-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی……………………………………………

 

 

 

49

 

 

3-2-9-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه………………………………………………………….

 

 

 

50

 

 

3-2-9-4 روش شستشوی تیمارها………………………………………………………………………………..

 

 

 

50

 

 

3-3 تهیه مواد گیاهی برای اسانس‌گیری………………………………………………………………………….

 

 

 

50

 

 

3-4 آنالیز اجزاء اسانس………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

51

 

 

3-5 تجزیه داده‌های آماری……………………………………………………………………………………………

 

 

 

 

 

 

         فصل چهارم: نتایج و بحث

 

 

 

52

 

 

4-1 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

55

 

 

4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه…………………………………………………….

 

 

 

56

 

 

4-2-1 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی……………………………………..

 

 

 

56

 

 

4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی………………………………………………….

 

 

 

57

 

 

4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه…………………………………………………………….

 

 

 

57

 

 

4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه……………………………………………………………

 

 

 

58

 

 

4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ…………………………………………………………….

 

 

 

58

 

 

4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه…………………………………………………………..

 

 

 

59

 

 

4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه……………………………………………………………..

 

 

 

60

 

 

4-2-8 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ………………………………………………….

 

 

 

60

 

 

4-3 استخراج اسانس……………………………………………………………………………………………………

 

 

 

صفحه

 

 

عنوان

 

 

 

60

 

 

4-3-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس…………………………………………

 

 

 

61

 

 

4-3-2 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه……………………………………………………….

 

 

 

62

 

 

4-3-3 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس……………………………………………………………………………

 

 

 

 

 

 

         فصل پنجم: نتیجه‌گیری

 

 

 

63

 

 

5-1 بحث…………………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

63

 

 

5-1-1 کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………

 

 

 

64

 

 

5-1-2 اثرات موتاژن EMS ……………………………………………………………………………………….

 

 

 

68

 

 

5-2 نتیجه‌گیری…………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

69

 

 

5-3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………

 

 

 

70

 

 

فهرست منابع فارسی…………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

74

 

 

فهرست منابع انگلیسی………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

86

 

 

چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………

 

 

چکیده

 

بادرنجبویه با نام علمی Melissa officinalis یکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. این پژوهش با قرار دادن ریز نمونه‌های بادرنجبویه به محیط کشت درون شیشه‌ای MS انجام شد و هدف تکثیر گیاه از طریق کشت بافت برای استفاده از تاثیر موثرتر ماده جهش‌زا و بدست آوردن نمونه‌های گیاهی جدید موتانت شده هم از طریق کشت بافت و هم در محیط مزرعه و بررسی تغییرات میزان مواد موثره اسانس موجود در گیاه در اثر ماده جهش‌زای اتیل متیل سولفانات (EMS) می‌باشد. این آزمایش هم بصورت مزرعه‌ای و هم بصورت آزمایشگاهی (کشت بافتی) مورد بررسی قرار گرفت. در تیمارهای آزمایشگاه، سرشاخه‌های رشد یافته در محیط MS بدون هورمون را با غلظت‌های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% EMS و در مدت زمان‌های 24 و48 ساعت اعمال شدند. در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شدند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیک از قبیل طول ساقه، طول ریشه، تعداد جوانه در ساقه، تعداد ریشه رونده جانبی، طول برگ و تعداد برگ در ساقه مورد ارزیابی قرار گرفته و پاسخ معنی‌داری را در سطح 5 درصد نشان دادند این آزمایش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر مرفولوژیک این گیاه دارویی دارد. بهترین نتیجه نیز از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند و تحت تیمار با غلظت 01/0% EMS بودند به‌دست آمد. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متیل سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.

 

کلمات کلیدی: بادرنجبویه (Melissa officinalis)، کشت درون شیشه‌ای، محیط کشت MS، اتیل متیل سولفانات(EMS)، مواد موثره

 

1-1 مقدمه:

 

گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ها دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند و در بسیاری از نقاط کشور رشد می‌یابند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با استفاده از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. در حال حاضر در قرن 21، طب گیاهی از جایگاه خاصی برخوردار است به گونه‌ای که در اتحادیه اروپا قوانینی مبنی بر لزوم انجام آزمایشات بالینی برروی گیاهان دارویی همانند داروهای شیمیایی وضع کرده است که بر اساس آن تمام داروهای گیاهی باید مجوز دریافت نمایند. اولین استفاده از گیاهان دارویی در خاورمیانه و مربوط به عصر پارینه سنگی است. شواهد استفاده از گیاهان دارویی توسط انسان به حدود شصت هزار سال پیش می‌رسد.

 

گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و می‌توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).

 

در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ها متعدد می‌باشد که از آن جمله می‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).

 

یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی[1] است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.

 

استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند.در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی[2] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته[3] و پلی پلوئید[4] را نام برد.

 

کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای[5] و یا کشت استریل نیز مطرح می‌شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب بیگی و همکاران، 1385؛ سونانداکوماری و همکاران[6]، 2003). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال 1756 توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس[7] در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری[8]، 1994).

 

اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمایش های وی روی کشت تک سلول ها پیشنهاد گردید (هابرلنت[9]، 1902). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می‌تواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه بادرنجبویه نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچون اتیل متیل سولفانات[10] (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.

 

1-1-1 اهمیت موضوع

 

برای انجام کشت بافت بادرنجبویه (Melissa officinalis L) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران[11]، 2011). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای (in vitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال 1976 توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقری و صفاری، 1387).

 

بادرنجبویه به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می‌شود (امیدبیگی ،1386؛ هوشیار قیصر،1388). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره بادرنجبویه صورت گرفته است (رجحان،1362؛ زرگری،1369؛ مومنی وشاهرخی،1377؛ آزادبخت،1378). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت، بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف، مطالعه متابولیت‌های ثانویه ،انتقال ژن و مهندسی ژنتیک برای این گیاه ضرورت دارد.