1-5-2- تحرک اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………………….12

 

1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم ……………………………………………………………………………………………………….14

 

1-5-4- قابلیت حیات اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….14

 

1-5-5- حجم………………………………………………………………………………………………………………………………………….15

 

1-5-6- غلظت………………………………………………………………………………………………………………………………………..16

 

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن………………………………………………………………………………………………………18

 

1-6-1- نکروز…………………………………………………………………………………………………………………………………………18

 

1-6-2- آپوپتوز سلولی…………………………………………………………………………………………………………………………..18

 

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ……………………………………………………………………………………………………………………….19

 

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………………………………………………………………….21

 

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز………………………………………………………………………………………….21

 

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………………………………………………………………..23

 

1-6-2-4-1-  بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………………………………………………23

 

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول……………………………………………………24

 

1-6-2-4-2-  بررسی سیتوتوکسیسیتی ………………………………………………………………………………………………24

 

1-6-2-4-3-  بررسی تغییرات مورفولوژی …………………………………………………………………………………………..25

 

1-6-2-4-3-1-  استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………………………………………………………25

 

1-6-2-4-3-2-  استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس………………………………………………………………..25

 

1-7-  منشاء آسیب DNA اسپرم…………………………………………………………………………………………………………26

 

1-7-1-  بسته بندی غیرطبیعی كروماتین……………………………………………………………………………………………27

 

1-8-  ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری …………………………………………………………………………28

 

1-8-1-  بررسی ساختار کروماتین اسپرم……………………………………………………………………………………………..28

 

1-9-  نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم………………………………………………………………………………………..29

 

1-10-  استرس اكسیداتیو به واسطه ROS…………………………………………………………………………………………30

 

1-11-  تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA  و میزان موفقیت روشهای کمک باروری…………………..31

 

1-11-1-  مصرف سیگار………………………………………………………………………………………………………………………..31

 

1-11-2-  مواجهات شغلی…………………………………………………………………………………………………………………….32

 

1-11-3-  داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………………………………………………………………33

 

1-11-4-  سن………………………………………………………………………………………………………………………………………..33

 

1-12-  تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین……………………………………………………………………………………….33

 

1-12-1-  روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………………………………………………………34

 

1-12-1-1- تست TUNEL……………………………………………………………………………………………………………….35

 

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………………………………………………………..35

 

1-12-1-3- روش Comet…………………………………………………………………………………………………………………..36

 

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3…………………………………………………………………………………………………………36

 

1-12-1-5- تكنیك SCSA………………………………………………………………………………………………………………..37

 

1-12-1-6- تست  SCD……………………………………………………………………………………………………………………..37

 

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ………………………………………………………………………………………………..39

 

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو………………………………………………………………………………………………….39

 

1-13- روش مهاجرت اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….39

 

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………………………………………………………………….40

 

فصل دوم- مواد و روش ها………………………………………………………………………………………………………………………41

 

2-1- مواد و وسایل  مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………42

 

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………….42

 

2-1-2- مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………………………..42

 

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………45

 

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10…………………………………………………………………………………………………….45

 

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………………………………………..46

 

2-2-3- ساخت محلول تانل……………………………………………………………………………………………………………………..46

 

2-2-4- ساخت محلول (PBS)……………………………………………………………………………………………………………….46

 

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین…………………………………………………………………………………………………….47

 

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………………………………………………………………..47

 

 

2-3- روشها………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48

 

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم…………………………………………………………………………………………………………….. 48

 

2-3-2- آنالیز مایع انزالی………………………………………………………………………………………………………………………… 48

 

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی…………………………………………………………………………………………………………..48

 

2-3-2-1-1-  ظاهر………………………………………………………………………………………………………………………………….48

 

2-3-2-1-2- آبکی کردن…………………………………………………………………………………………………………………………48

 

2-3-2-1-3-  حجم………………………………………………………………………………………………………………………………….48

 

2-3-2-1-4-  چسبندگی…………………………………………………………………………………………………………………………48

 

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی………………………………………………………………………………………………………….49

 

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………..50

 

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم…………………………………………………………………………………………………………..50

 

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش ………………………………………..50

 

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………………………………………………………………………51

 

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….52

 

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات…………………………………………………………………………………………………………53

 

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………………………………………………………53

 

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی………………………………………………………………………………………………………………54

 

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………………54

 

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………………………………………………………………..54

 

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………55

 

2-3-3-  Direct swim-up………………………………………………………………………………………………………………………57

 

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………….57

 

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)……………………………………………………………58

 

2-3-4-1- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………………58

 

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل…………………………………………………………………………………………………………………60

 

2-3-6- آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………………………………………….62

 

فصل سوم- نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………………..63

 

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی تحرک اسپرم………………………………64

 

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قابلیت حیات اسپرم………………….67

 

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی مورفولوژی اسپرم……………………..68

 

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70

 

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………….72

 

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی آپوپتوز اسپرم………………………………………………………………………………………………………………75

 

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم……………………………………78

 

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم…………………………………………………………………..79

 

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم…………………………………………..80

 

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………80

 

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………………………………………………………………….81

 

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم………………………………………83

 

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………..84

 

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….90

 

منابع

 

چکیده انگلیسی

 

 

 

فهرست شکل ها

 

عنوان                                                                                                          صحنه

 

1-1- ساختار اسپرم انسانی……………………………………………………………………………………………………………………..9

 

1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: …………..…………….…A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337

 

1-3- تست  SCD………………………………………………………………………………………………………………………………….38

 

2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون…………………………………………………………………………………………………………..50

 

2-2- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود………………………………………………51

 

2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER …………………………………………………………………………………….52

 

2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور…………………………………………………….57

 

3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم…………………………….67

 

3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا ………………………………………………………………………………………………………………….69

 

3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد……………………………………74

 

3-4- رنگ آمیزی TUNEL………………………………………………………………………………………………………………….76

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول ها

 

عنوان                                                                                                   صفحه

 

1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO)…………………………………………………………………………………………………………………………………….17

 

2-1- ساخت Ham’sf10……………………………………………………………………………………………………………………..45

 

2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………………………………………………55

 

3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ……………………………………………………..71

 

3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم……………………………………..77

 

3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………..77