3-3-2-   تایید استخراج پلاسمید حاوی ژن سنتتیک با روش آگارز ژل الکتروفورز 38

 

3-3-3-   آماده سازی نمونهها برای الکتروفورز 38

 

3-3-4-   رنگ آمیزی DNA در ژل آگارز 39

 

3-3-5-   تهیه بافر TBE(10X) 39

 

3-3-6-   طرز تهیه ژل آگارز 39

 

3-3-7-   هضم آنزیمی وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزیم NdeI 40

 

3-3-8-   هضم آنزیمی وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزیم BamHI 41

 

3-3-9-   تخلیص ژن سنتتیک dr2418 از روی ژل. 41

 

3-3-10-   برش پلاسمید pET-21a توسط آنزیم NdeI 43

 

3-3-11-   برش وکتور pET-21a (هضم شده با NdeI) توسط BamHI 43

 

3-3-12-   لیگاسیون وکتور pET-21a و ژن سنتتیک dr2418. 44

 

3-3-13-   ترنسفورماسیون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5a. 45

 

3-4-   توالییابی ژن سنتتیک در pET-21a. 45

 

3-5-   القاء ساختارهای بیانی pET21a-dr2418 توسط IPTG به منظور تولید پروتئین DR2418 دارای برچسب هیستیدین (His-tagged r-dR2418): 46

 

3-6-   ارزیابی پروتئین DR2418 تولید شده به وسیله الكتروفورز در ژل پلی آكریلامید (SDS-PAGE) 47

 

3-7-   یكسان سازی غلظت كلی پروتئینها در نمونه های قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE. 50

 

3-8-   شناسائی و تائید پروتئین His-tagged r-DR2418 با روش Western blot 50

 

3-9-   نگهداری و ذخیره باكتریهای مولد پروتئین ِDR2418: 52

 

3-10-   بررسی پایداری پلاسمیدها (Plasmid stability Test) 53

 

3-11-   خالصسازی پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی. 53

 

3-11-1-   لیز سلولی باکتری E.coli 54

 

3-11-2-   آماده كردن ستون. 54

 

3-11-3-   تزریق نمونه و شستشو. 55

 

3-11-4-   جدا سازی یپروتئین نوترکیب.. 55

 

3-11-4-1-   روش دیالیز. 56

 

3-11-5-1- رسم منحنی استاندارد 56

 

3-11-5-2- تهیۀ محلول برادفورد 57

 

3-11-6-   بازیافت و نگهداری ستون. 57

 

 فصل چهارم : نتایج.. 58

 

4-1-   غربال كردن كلنی های حاوی pGEM-B1 دارای قطعه DR2418: 59

 

4-2-   غربال كردن كلنیهای E. coli DH5 حاوی pGEM-B1 دارای قطعه 59

 

4-2-1-   تایید پلاسمیدهای استخداج شده با برش آنزیمی NdeI: 60

 

4-2-2-   تایید پلاسمیدهای خطی شده حاوی ژن سنتتیک با هضم آنزیمی BamHI: 60

 

4-3-   جداسازی قطعه از روی ژل و فرایند Ligation: 61

 

 

4-3-1-   تایید صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعیین توالی: 63

 

4-4-   ترانفسفورم وکتور pET21a حاوی ژن dr2418 به سلول E. coli Origami و ارزیابی بیان پروتئین DR2418: 64

 

4-5-   شناسائی و تائید پروتئین DR2418 با روش Western Blot Wet transfer)) 64

 

4-6-   بیان ژن dr2418 در حجم یک لیتر محیط کشت.. 66

 

4-7- برسی تخلیص پروتئین بر روی ژل SDS_PAGE: 67

 

4-8- نتایج سنجش غلظت پروتئین: 67

 

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری…………. 69

 

 ضمیمه: 76

 

 پیشنهادات: 84

 

 منابع. 85

 

 چكیده انگلیسی.. 91

 

چکیده

 

زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو است و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو نقش دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو است. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد.