1-5-4 مكانیسم های انحلال فسفر توسط میکروارگانیسم ها. 12

 

1-6- اثر میكروارگانیسم های ریزوسفری بر گیاهان. 14

 

1-7- کودهای کشاورزی. 17

 

1-7-1 مقایسه انواع مختلف کودها. 17

 

1-7-2 کود زیستی (Biofertilizer) 18

 

1-7-3 دسته بندی کودهای زیستی. 19

 

1-7-4 اثرات سوء کودهای شیمیایی. 19

 

1-7-5 دلایل اهمیت استفاده از کودهای زیستی. 20

 

1-7-5-1 اهمیت کودهای بیولوژیک در سلامتی انسان. 21

 

1-8- پیشینه استفاده از کودهای زیستی. 22

 

1-9- جایگاه تولید كودهای زیستی در ایران و جهان. 23

 

1-10- تولید کودهای زیستی. 25

 

1-10-1 ویژگی ماده حامل. 26

 

1-11- کودهای زیستی باکتریایی. 27

 

1-12- کودهای زیستی فسفاته. 28

 

1-13- لیگنیت. 29

 

1-14- ویژگی های گیاه تربچه. 30

 

1-14-1 خصوصیات گیاه شناسی. 30

 

1-14-2 شرایط اقلیمی. 31

 

1-14-3 کشت تربچه. 33

 

1-15- اهداف تحقیق. 34

 

1-16- فرضیه های تحقیق. 34

 

فصل دوم: بر ادبیات و پیشینه تحقیق

 

2-1- پیشینه تحقیق. 36

 

2-2- هدف پژوهش. 40

 

فصل سوم: روش اجرای تحقیق

 

3-1- تهیه کشت جوان و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده   42

 

3-1-1 رنگ آمیزی گرم. 42

 

3-1-2 تکنیک کاور اسلیپ. 42

 

3-2- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات در مقیاس آزمایشگاهی. 43

 

3-3- ارزیابی به کارگیری افزودنی­های لازم برای افزایش بقا سویه مورد نظر نسبت به تنش های محیطی مشتمل بر خشکی، شوری، دما، UV، pH    44

 

3-3-1 آماده سازی ماده حامل جهت تلقیح با باکتری. 44

 

3-3-2 اعمال تنش های محیطی بر روی تیمارها. 45

 

3-3-2-1 محیط کشت استارچ کازئین آگار. 46

 

3-3-2-2 محلول  كدورت سنجی مك فارلند. 46

 

3-3-2-3 محلول رقیق كننده. 47

 

3-4- اعمال بهترین تیمار به گلدان ها و بررسی پایداری باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه. 47

 

3-4-1 روش كشت گلدانی تربچه. 47

 

3-5- تاثیر سطوح مختلف تلقیح بر روی بقاء در سطح بذر تربچه   48

 

3-6- تاثیر سطوح مختلف تلقیح به کار برده شده در جذب فسفات توسط گیاه تربچه. 48

 

3-6-1 اندازه گیری غلظت فسفر گیاه تربچه. 48

 

3-6-2 روش ساخت معرف وانادات – مولیبدات. 49

 

3-6-3 روش تهیه محلول های استاندارد فسفر و رسم منحنی استاندارد   49

 

3-7- بررسی بقاء باکتری در حامل‏های مختلف. 50

 

3-8- نگهداری سویه مورد نظر برای مطالعات بعدی. 50

 

3-8-1 محیط كشت نوترینت براث (Nutrient Broth) 51

 

3-8-2 محیط كشت TSA.. 51

 

3-9- نتایج آنالیز خاک گلدان قبل از آزمون و پس از آزمون   52

 

3-10-  تجزیه وتحلیل آماری داده ها. 52

 

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده‏ها

 

4-1- تهیه محیط کشت تازه و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده   54

 

4-2- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات   54

 

4-3- تاثیر مواد حامل بر بقاء سویه باکتری. 55

 

 

4-3-1 تاثیر تنش دمایی بر افزایش بقاء باکتری در فرمول   55

 

4-3-2 تاثیر تنش شوری بر افزایش بقاء باکتری در فرمول. 65

 

4-3-3 تاثیر تنش خشکی بر افزایش بقا باکتری در فرمول. 73

 

4-3-4 تاثیر تنش PH بر افزایش بقا باکتری در فرمول. 76

 

4-3-5 تاثیر تنش UV بر افزایش بقا باکتری در فرمول. 84

 

4-4- اعمال بهترین تیمار به گلدان و بررسی پایداری باکتری در ریزوسفر گیاه. 89

 

4-6- تاثیر سطوح مختلف تلقیح به کار برده شده در جذب فسفات توسط گیاه و نتایج آنالیز فسفات خاک گلدان‏ها و آنالیز فسفات گیاه   96

 

4-7- بررسی بقاء باکتری در حامل‏های مختلف. 103

 

فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات

 

5-1- نتیجه گیری. 111

 

5-2- پیشنهادات. 119

 

منابع و مآخذ. 121

 

فهرست منابع فارسی. 121

 

فهرست منابع انگلیسی. 123

 

چکیده انگلیسی. 126

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

 

عنوان                                                  شماره صفحه

 

جدول 1-1- فهرستی از كودهای زیستی فسفاته داخل کشور.. 25

 

جدول 2-1- درجه حرارت های مورد نیاز گیاه تربچه.. 32

 

جدول 3-1- ترکیبات محیط کشت PVK.. 43

 

جدول 3-2- ترکیبات محیط کشت استارچ کازئین آگار.. 46

 

جدول 3-3- ترکیبات سرم فیزیولوژی.. 47

 

جدول 3-4-  ترکیبات محیط کشت نوترینت براث.. 51

 

جدول 3-5- نتایج آنالیز مینرالوژی و تجزیه سرندی خاک.. 52

 

جدول 3-6- توزیع اندازه ذرات خاک.. 52

 

جدول 4-1- میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف دمایی (درجه سانتیگراد).. 55

 

جدول 4-2- میانگین بقاء باکتری در زمان‏ (روز شمارش).. 55

 

جدول 4-3- میانگین بقاء باکتری در رقت‏های مختلف.. 55

 

جدول 4-4- تجزیه واریانس سطوح مختلف دما بر بقاء باکتری.. 56

 

جدول 4-5- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری.. 56

 

جدول 4-6- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری.. 56

 

جدول 4-7- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف دما به روش دانکن (α < 0.05).. 57

 

جدول 4-8- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف دما به روش دانکن (α <0.05).. 57

 

جدول 4-9- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف رقت به روش دانکن (α <0.05).. 57

 

جدول 4-10- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده در تنش دمایی.. 58

 

جدول 4-11- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری.. 58

 

جدول 4-12- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن (α <0.05).. 59

 

جدول 4-13- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای دما، رقت، زمان شمارش کلنی‏ها و مواد حامل فرموله شده.. 60

 

جدول 4-14- میزان معنی داری فاکورهای دما (Temperature)، رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری در تنش دمایی.. 62

 

جدول 4-15- میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف شوری.. 65

 

جدول 4-16- میانگین بقاء باکتری در زمان‏ (روز شمارش).. 65

 

جدول 4-17- میانگین بقاء باکتری در رقت‏های مختلف.. 65

 

جدول 4-18- تجزیه واریانس سطوح مختلف شوری بر بقاء باکتری   66

 

جدول 4-19- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری.. 66

 

جدول 4-20- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری.. 66

 

جدول 4-21- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف شوری  به روش دانکن (α <0.05).. 66

 

جدول 4-22- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف زمان به روش دانکن (α <0.05).. 67

 

جدول 4-23- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف رقت به روش دانکن (α <0.05).. 67

 

جدول 4-24- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده در تنش شوری.. 67

 

جدول 4-25- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری تحت تنش شوری.. 68

 

جدول 4-26- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن  در تنش شوری(<0.05).. 68

 

جدول 4-27- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای شوری، رقت، زمان شمارش کلنی‏ها و مواد حامل فرموله شده.. 69

 

جدول 4-28- میزان معنی داری فاکورهای شوری (Salinity)، رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری در تنش شوری.. 71

 

جدول 4-29- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف خشکی  و مواد حامل به روش دانکن (α <0.05) ……………………. 72

 

جدول 4-30- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده در تنش خشکی…………………………………… 73

 

جدول 4-31- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری در تنش خشکی به روش دانکن       (α <0.05)……………….. 73

 

جدول 4-32- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای خشکی و مواد حامل فرموله شده…………………………….. 73

 

جدول 4-33- میزان معنی داری فاکورهای خشکی و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری.. 75

 

جدول 4-34- تجزیه واریانس سطوح مختلف pH بر بقاء باکتری.. 76

 

جدول 4-35- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری.. 76

 

جدول 4-36- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری.. 77

 

جدول 4-37- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف pH  به روش دانکن (α <0.05).. 77

 

جدول 4-38- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف زمان به روش دانکن تحت تاثیر تنش pH (α <0.05).. 77

 

جدول 4-39- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف رقت به روش دانکن تحت تاثیر تنش pH(α <0.05).. 78

 

جدول 4-40- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده تحت تاثیر تنش pH.. 78

 

جدول 4-41- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری.. 78

 

جدول 4-42- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن (α <0.05).. 79

 

جدول 4-43- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای pH ، رقت، زمان شمارش کلنی‏ها و مواد حامل فرموله شده.. 80

 

جدول 4-44- میزان معنی داری فاکورهای pH ، رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و                                             مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری.. 82

 

جدول 4-45- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری در تنش uv. 84

 

جدول 4-46- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری در تنش uv  84

 

جدول 4-47- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف uv به روش دانکن (α <0.05).. 85

 

جدول 4-48- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف رقت به روش دانکن تحت تنش uv  (α <0.05).. 85

 

جدول 4-49- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده تحت تنش uv. 86

 

جدول 4-50- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری تحت تنش uv. 86

 

جدول 4-51- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن تحت تنش uv        (α <0.05).. 86

 

جدول 4-52- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای uv، رقت، زمان شمارش کلنی‏ها و مواد حامل فرموله شده.. 87

 

جدول 4-53- میزان معنی داری فاکورهای uv، رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (min) و                                             مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری.. 88

 

جدول 4-54- میانگین بقاء باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه بر اساس مواد حامل فرموله شده.. 90

 

جدول 4-55- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه.. 90

 

جدول 4-56- مقایسه میانگین بقاء باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه به روش دانکن (α <0.05).. 91

 

جدول 4-57- میانگین بقاء باکتری در مواد حامل مختلف تلقیح شده به بذر.. 92

 

جدول 4-58- میانگین بقاء باکتری در زمان‏ (روز شمارش).. 92

 

جدول 4-59- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن (α <0.05).. 93

 

جدول 4-60- مقایسه میانگین بقاء باکتری در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 93

 

جدول 4-61- میانگین بقاء باکتری در مواد حامل فرموله شده و زمان شمارش کلنی‏ها.. 94

 

جدول 4-62- میزان معنی داری فاکورهای زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری.. 94

 

جدول 4-63- میزان معنی داری فاکورهای طول برگ (Leaf Lenght)، وزن خشک (Dry Weight) ،  وزن تر (Fersh Weight) ، فسفات خاک (Soil Phosphate) و فسفات گیاه (Plant Phosphate)بر بقاء باکتری.. 96

 

جدول 4-64- مقایسه میانگین طول برگ در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 97

 

جدول 4-65- مقایسه میانگین وزن خشک در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 97

 

جدول 4-66- مقایسه میانگین وزن تر در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 98

 

جدول 4-67- مقایسه میانگین فسفات خاک در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05). 98

 

جدول 4-68- مقایسه میانگین فسفات گیاه در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 99

 

جدول 4-69- میانگین بقاء باکتری در زمان‏ (روز شمارش) در دوره 3 ماهه.. 103

 

جدول 4-70- میانگین بقاء باکتری در رقت‏های مختلف در دوره 3 ماهه   103

 

جدول 4-71- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری در دوره 3 ماهه.. 104

 

جدول 4-72- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری در دوره 3 ماهه.. 104

 

جدول 4-73- مقایسه میانگین بقاء باکتری در حامل‏های مختلف در زمان های شمارش مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 104

 

جدول 4-74- مقایسه میانگین رقت بر بقاء باکتری به روش دانکن  در دوره 3 ماهه (α <0.05).. 105

 

جدول 4-75- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده در دوره 3 ماهه.. 105

 

جدول 4-77- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن (α <0.05).. 106

 

جدول 4-78- میانگین بقاء باکتری در مواد حامل فرموله شده، رقت و زمان شمارش کلنی‏ها.. 107

 

جدول 4-79- میزان معنی داری فاکورهای رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری   108

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست نمودارها

 

عنوان                                                  شماره صفحه

 

نمودار 3-1- منحنی استاندارد فسفر(گیاه).. 50

 

نمودار 4-1- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (روز).. 63

 

نمودار 4-2- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور دما (درجه سانتیگراد).. 63

 

نمودار 4-3- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت   64

 

نمودار 4-4- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور شوری (درصد).. 72

 

نمودار 4-5- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (روز) تحت تنش شوری.. 72

 

نمودار 4-6- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش شوری.. 73

 

نمودار 4-7- تاثیر سطوح مختلف خشکی و ماده حامل بر بقاء باکتری در فرمول.. 76

 

نمودار 4-8- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور pH   83

 

نمودار4 -9- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (روز) تحت تنش pH.. 83

 

نمودار 4-10- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش pH.. 84

 

نمودار 4-11- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (دقیقه) تحت تنش uv. 88

 

نمودار 4-12- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش uv. 89

 

نمودار 4-14- بقا باکتری در سطوح مختلف تلقیح.. 95

 

نمودار 4-15- اندازه طول برگ در تیمارها.. 99

 

نمودار 4-16- وزن خشک گیاه در تیمارها.. 100

 

نمودار 4-17- وزن تر گیاه در تیمارها.. 100

 

نمودار 4-18- آنالیز فسفات خاک گلدان ها در تیمارها.. 101

 

نمودار 4-19- آنالیز فسفات گیاه در تیمارها.. 101

 

نمودار 4-21- بقا باکتری در حامل‏ و رقت‏های مختلف در مدت 90 روز   108

 

نمودار 4-22- بقا باکتری در حامل‏های مختلف در مدت 90 روز.. 109

 

نمودار 4-23- بقا باکتری درمدت زمان 90 روز‏ و رقت‏های مختلف   109

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها  

 

عنوان                                                  شماره صفحه

 

شکل 1-1- تغییر و تبدیلات فسفر خاک توسط باکتری ها. 11

 

شکل 1-2- مکانیسم های انحلال فسفات توسط باکتری. 14

 

شکل 1-3- تاثیر باکتری های حل کننده فسفات روی گیاهان. 16

 

شکل 1-4- لیگنیت. 30

 

شکل 1-5- گیاه تربچه. 31

 

شکل 1-6- تربچه نقلی یا چهار فصل. 34

 

شکل 3-1- تیمارهای فرموله شده از لیگنیت، سویا، خاک فسفات   44

 

شکل 4-1- کشت تازه از سویه روی محیط pvk. 54

 

شکل 4-2-کشت روی محیط pvk. 54

 

شکل 4-3- مقایسه ظاهری تیمار فرمول با کنترل. 90

 

شکل 4-4- تیمارهای بکارگرفته شده در گلدان ها در هفته اول و دوم   102

 

شکل 4-5- مقایسه ظاهری تیمارها با کنترل. 102

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

چکیده

 

مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسان­ها و دیگر موجودات زنده شده است. به همین علت امروزه استفاده از کودهای زیستی مورد توجه قرار گرفته است. باکتری­های حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر می رسند. با توجه به اینکه اغلب خاک های ایران آهکی بوده و در اقلیم‏های خشک و نیمه خشک هستند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمبود مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اغلب محصولات کشاورزی باشد، لذا هدف از این پژوهش بررسی تاثیر spp.  Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد. جهت حداکثر افزایش بقاء باکتری در ماده حامل از سطوح تلقیح مختلفی که شامل لیگنیت و مواد تکمیلی پودر سویا و خاک فسفاته با نسبتهای مشخص بود استفاده شد و این مواد حامل تلقیح شده تحت تنشهای دما، شوری، خشکی، pH و uv قرار گرفتند همچنین کلیه مواد حامل ساخته و تلقیح شده بطور جداگانه در یک بازه زمانی 90 روز از لحاظ بررسی بقاء باکتری سنجیده شدند. بهترین فرمول به دست آمده از تنشها در گلدان به کارگیری شد. همچنین تیمارهای دیگری نیز از لیگنیت با سطوح مختلف ساخته و با باکتری و بذر تربچه تلقیح شد و بقاء باکتری در بازه 24 ساعته اندازه گیری شد و بعد از آن در گلدان به کار گرفته شدند. با توجه به نتایج به دست آمده بهترین فرمول به دست آمده از تنش­ها و بازه زمانی 90 روز، فرمول لیگنیت + خاک فسفات 2% + سویا 1% تعیین شد و بعد از بکارگیری در گلدان بهترین نتیجه را نسبت به سایر مواد حامل و کنترل نشان داد و پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه را بهتر از تمامی مواد حامل و کنترل افزایش داده است. از بین تیمارهای ساخته شده و تلقیح شده به بذر تیمار شامل 200 گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتایج را نشان داد و بعد از به کارگیری تیمارها در گلدان نیز تیمار شامل 200 گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتیجه را نشان داد. این فرمول بهترین نتیجه را در پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه نسبت به سایر تیمارها نشان داد. در یک نتیجه گیری کلی، فرمول لیگنیت + خاک فسفات 2% + سویا 1% به عنوان فرمول نهایی و اصلی برای به کارگیری در آزمایشات بعدی و مقیاس مزرعه پیشنهاد می‏گردد.

 

1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی (RAPD) 13

 

1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP) 13

 

1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشان‌مند از ردیف (STS) 14

 

1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP) 15

 

1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌ها 15

 

1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنوم. 16

 

1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراری.. 16

 

1-5-1 کراسینگ‌اور نابرابر. 17

 

1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردنDNA  در طول رشته (خطاهای همانند‌سازی) 17

 

1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشونده 19

 

1-6-1 مدل جهش گام به گام. 19

 

1-6-2 مدل آللی نا‏محدود. 19

 

1-7 مارکرهای STR.. 20

 

1-8 کاربرد مارکرهای STR.. 20

 

1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی.. 20

 

1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادث.. 21

 

1-8-3 تعیین هویت در موارد جنایی.. 22

 

1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویه. 22

 

1-8-3-2 ردیابی مجرمین.. 22

 

1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی.. 23

 

1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STR.. 25

 

1-9-1 جمع‌آوری سلول‌های جنینی از خون مادر 25

 

1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها 26

 

1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترک.. 26

 

1-9-4 تشخیص کلون‏های موفق.. 26

 

1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضو. 26

 

1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکی.. 26

 

1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولی.. 27

 

1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانی.. 27

 

1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی.. 27

 

1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید‌کردن با DNA جستجوگر. 27

 

1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت‌نگاری.. 29

 

1-10-2 روش پروفایلینگ… 29

 

1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR.. 30

 

1-12 CODIS چیست؟. 31

 

1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت.. 32

 

1-14 معرفی استان‏ها 34

 

1-14-1 استان کرمانشاه 34

 

1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی.. 34

 

1-14-2 استان یَزد. 35

 

1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی.. 36

 

1-15 هدف از تحقیق: 37

 

فصل دوم. 38

 

2-1 نمونه‌گیری.. 39

 

2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباع. 39

 

2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typing. 40

 

۲-3-1 رسوب‌گذاری با اتانول. 41

 

2-3-2 تعیین غلظت نمونه‌های DNA توسط دستگاه Nanodrop. 42

 

2-3-3 تهیه‌ی Working Stoke. 42

 

2-4 تست DNA Typing. 43

 

2-4-1 Multiplex PCR.. 43

 

2-5 مواد و تجهیزات مورد نیاز در DNA Typing. 44

 

2-5-1 آزمایش DNA Typing. 44

 

 

2-5-2 جداسازی قطعات.. 45

 

2-5-2-1 تجهیزات لازم. 45

 

2-5-2-2 آماده‌سازی دستگاه جهت جداسازی قطعات.. 46

 

2-5-2-3 روش جداسازی قطعات.. 46

 

2-6 آنالیز داده‌ها 47

 

3-1 نمونه‏ها 53

 

3-2 پروفایل ژنتیکی.. 53

 

3-2 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏ها 55

 

3-3 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏های کرمانشاه 56

 

3-4 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‌های یزد. 60

 

فصل چهارم. 65

 

4-1 بحث.. 66

 

4-2 نتیجه‏گیری.. 73

 

4-3 پیشنهادات.. 73

 

منابع انگلیسی.. 74

 

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………….75

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

 

شکل 1-1 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی ]10[ 7

 

جدول 1-1 جایگاه‏های موجود در کیت ABI 33

 

جدول2-1 محلولI استخراج DNA (محلول لیز‌کننده گلبول‌های قرمز) 39

 

جدول 2-2 محلول II استخراج DNA (محلول لیز‌کننده گلبول‌های سفید) 40

 

جدول 2-3 ترکیبات TE. 40

 

جدول 2-4 شرایط PCR.. 45

 

جدول ۲-5 تنظیمات دستگاه ABI3130 در جداسازی قطعات STR.. 46

 

شکل2-4 چگونگی عملکرد دستگاه الکتروفورز موئینه‌ای[26] 47

 

جدول 2-6 مواد فلورسنت موجود در کیت ABI و رنگهایشان. 48

 

شکل2-5 مواد مختلف در طول موج‌های متفاوتی نور خود را ساطع می‌کنند[26] 48

 

جدول 2-7 ماده فلورسنت مورد استفاده برای هر جایگاه[25] 49

 

شکل3-1 پروفایل ژنتیکی یک فرد. 54

 

جدول3- 2 فراوانی آللی و سایر پارامترهای جمعیتی و پزشکی‌قانونی در جمعیت یزد را نشان می‏دهد. 60

 

جدول 4-1 مقایسه جمعیت کرمانشاه با سایر جمعیت‏ها 67

 

جدول 4-2 مقایسه جمعیت یزد با سایر جمعیت‏ها 68

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل‌ها

 

شکل 1-2 کراسینگ‌آور و مبادلات نابرابر بین کروماتیدهای خواهری سبب ایجاد حذف‌شدگی یا الحاق می‌شود]23.[. 17

 

شکل 1-3 متزلزل بودن پلی‌مراز حین همانندسازی DNA می‏تواند طول تکرار را به اندازه یک یا دو واحد تغییر دهد [23]. 18

 

شکل 1-4 آلل‏های فرزندان مجموعه‏ای از آلل‏های والدین آنها می‏باشد [62]. 21

 

شکل 1-5 شناسائی مجرمین به کمک مارکرهای  STR[26]. 23

 

شکل 1-6 مراحل انگشت‌نگاری ژنتیکی [38]. 28

 

شکل 1-7 مراحل پروفایلینگ  DNA[36]. 30

 

شکل 1-8 جایگاه‌های CODIS روی کروموزوم‌های انسان[25]. 32

 

شکل 1-9 موقعیت جغرافیائی استان کرمانشاه [44]. 35

 

شکل 1-10 موقعیت جغرافیائی استان یزد[45]. 36

 

شکل2-2 استفاده از Multiplex PCR در روش پروفایلینگ[36] 44

 

شکل 2-3 دستگاه الکتروفورز موئینه ای[51] 46

 

شکل 2-6ladder به‌کاررفته در کیت ABI[25] 50

 

شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی میان سیزده جمعیت مختلف[46] 71

 

شکل 4-2.درخت فیلوژنتیکی میان نه جمعیت مختلف[46] 71

 

 

 

 

 

 

 

فهرست نمودار‌ها

 

نمودار3-1 پارامترهای ژنتیکی جمعیت استان کرمانشاه برحسب درصد. 60

 

نمودار3-2 پارامترهای ژنتیک جمعیت استان یزد برحسب درصد. 64

 

 

 

 

 

 

 

چکیده

 

 

 

 

 

بررسی تنوع ژنتیکی اقوام ایرانی با استفاده از STR     مونا داودبیگی

 

بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها با استفاده ار تعیین فراوانی آللی و پارامترهای ژنتیکی روش نوینی است که در سال‏های گذشته در بسیاری از جمعیت‏های جهان صورت گرفته و با استفاده از آن شباهت بسیاری از جمعیت‏ها به یکدیگر مشخص گردیده. شباهت جمعیت‏ها نشان‌دهنده‏ی همسان‌بودن خزانه‏ی ژنتیکی آنها و احتمالا یکسان‌بودن آن جمعیت‏ها در گذشته است. پس این احتمال وجود دارد که این جمعیت‏ها در گذشته یک جمعیت بوده باشند و بعد‏ها به دلایل جغرافیایی و یا مهاجرت‏ها از یکدیگر جدا شده باشند. یکی از راه‏های بررسی تنوع‌ ژنتیکی در جمعیت‏ها استفاده از توالی‏های کوتاه تکراری می‏باشد .هدف این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی در دو قوم یزد و کرد (کرمانشاه) از ایران بود. بدین منظور پروفایل ژنتیکی پنجاه فرد غیر‌خویشاوند از هر یک از جمعیت‏های کرمانشاه و یزد با استفاده از کیت  ABIتهیه شد. این کیت حاوی پانزده جایگاه D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOX و TH01 و ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت افراد) می‏باشد. نتایج نشان‌دادند که به جز دو جایگاه D7S820 وD19S433  در جمعیت کرمانشاه و سه جایگاه D21S11 ,D19S433 و VWA در یزد سایر جایگاه‏ها در تعادل هاردی‏واینبرگ بودند. همچنین پارامترهای پزشکی‌قانونی شامل PIC,PD,PE,MP در این مطالعه بررسی شدند. سپس دو جمعیت با جمعیت‏های کشورهای همسایه مقایسه شدند. این مطالعه نشان داد که این جایگاه‏ها، جایگاه‏های مناسب برای استفاده در تست‏های تعیین هویت و مطالعات جمعیتی می‏باشند. در نتیجه‏‏ی مقایسات هم دیده شد که هر دو جمعیت یزد و کرمانشاه شباهت زیادی به جمعیت کشور ترکیه داشتند ولی با سایر کشورها متفاوت بودند. از طرفی یزد نسبت به کرمانشاه دارای جمعیت همگن‌تری بود که این مسئله می‏تواند به‌علت بکر بودن این جمعیت در طول سالیان مختلف باشد.

 

کلمات کلیدی: توالیهای کوتاه تکراری، نشانگرهای مولکولی، ژنتیک جمعیت

 

 

 

 

 

2ـ4ـ2ـ علائم منفی…………………………………………………………………………………………………………………                           6

 

2ـ4ـ3ـ نقائص شناختی…………………………………………………………………………………………………………..                           6

 

2ـ5ـ انواع اسکیزوفرنی……………………………………………………………………………………………………………..                           6

 

2ـ6ـ اتیولوژی……………………………………………………………………………………………………………………………                          7

 

2ـ7ـ وراثت پذیری و اثرات محیطی…………………………………………………………………………………………                          7

 

2ـ8ـ هیپوکامپ در اسکیزوفرنی……………………………………………………………………………………………….                          7

 

2ـ9ـ اکسی توسین و گابا در اختلال اسکیزوفرنی……………………………………………………………………                          7

 

2ـ10ـ اکسی توسین و متابولیک ایمنی اسکیزوفرنی……………………………………………………………….                          8

 

2ـ11ـ  هورمون…………………………………………………………………………………………………………………………                          9

 

2ـ11ـ1ـ انواع هورمون…………………………………………………………………………………………………………….                           9

 

2ـ11ـ2ـ نحوه انتقال هورمون در خون…………………………………………………………………………………..                           9

 

2ـ11ـ3ـ نحوه تاثیر هورمون ها………………………………………………………………………………………………                           9

 

2ـ11ـ4ـ غده هیپوفیز……………………………………………………………………………………………………………..                         10

 

2ـ12ـ ویژگی های عمومی اکسی توسین……………………………………………………………………………….                         10

 

2ـ13ـ نقش اکسی توسین……………………………………………………………………………………………………….                         11

 

2ـ14ـ کنترل ترشح اکسی توسین………………………………………………………………………………………….                         11

 

2ـ15ـ توزیع و نقش گیرنده های اکسی توسین……………………………………………………………………..                         12

 

2ـ16ـ فعال سازی سیگنالینگ PKC از طریق Gـ پروتئین……………………………………………………                        13

 

فصل سوم: مواد و روش ها…………………………………………………………………………………..                          15

 

3ـ1ـ جمع آوری نمونه……………………………………………………………………………………………………………..                         16

 

3ـ2ـ نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………………………                        16

 

3ـ3ـ مواد و محلول های مورد نیاز برای انجام استخراج………………………………………………………….                        16

 

3ـ4ـ مراحل استخراج……………………………………………………………………………………………………………….                        17

 

3ـ5ـ واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)………………………………………………………………………………..                        18

 

3ـ6ـ بررسی پلی مورفیسم rs2254298 ژن OXTR……………………………………………………………                         19

 

3ـ7ـ فرایند انجام واکنش PCR……………………………………………………………………………………………….                        19

 

3ـ7ـ1ـ  مواد و وسایل مورد نیاز برای انجام PCR…………………………………………………………………….                      19

 

3ـ7ـ2ـ محلول های مورد نیاز برای واکنش PCR……………………………………………………………………                       20

 

3ـ7ـ3ـ روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….                        20

 

3ـ7ـ4ـ مراحل انجام PCR……………………………………………………………………………………………………….                       21

 

3ـ8ـ RFLPـPCR…………………………………………………………………………………………………………………….                       22

 

3ـ8ـ1ـ مراحل و مواد مورد نیاز برای انجام RFLP………………………………………………………………….                       23

 

3ـ8ـ2ـ آنزیم BsrӀ……………………………………………………………………………………………………………………                        23

 

3ـ8ـ3ـ روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….                        23

 

3ـ9ـ مراحل و مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز…………………………………………………………………                       24

 

3ـ9ـ1ـ مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………….                        24

 

3ـ9ـ2ـ تهیه ژل آگارز 3 درصد…………………………………………………………………………………………………                       24

 

3ـ10ـ بررسی پلی مورفیسم rs53576…………………………………………………………………………………..                         25

 

3ـ10ـ1ـ آنزیم BamHӀ……………………………………………………………………………………………………………                       25

 

3ـ10ـ2ـ روش کار……………………………………………………………………………………………………………………..                       26

 

3ـ11ـ آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………..                       26

 

فصل چهارم: نتایج……………………………………………………………………………………………….                        27

 

4ـ1ـ اطلاعات بیماران و افراد سالم……………………………………………………………………………………………                       28

 

4ـ2ـ بررسی پلی مورفیسم rs2254298 در ژن گیرنده اکسی توسین…………………………………..                        29

 

آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………………………………………………                      30

 

4ـ3ـ بررسی پلی مورفیسم برای (A/G) ژن OXTR…………………………………………………………………                     32

 

4ـ3ـ1ـ آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………………………………….                      33

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری و ارائه پیشنهادات………………………………………………….                      34

 

5ـ1ـ بحث……………………………………………………………………………………………………………………………………..                     35

 

5ـ2ـ پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………                     37

 

مراجع…………………………………………………………………………………………………………………..                      38

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول ها

 

عنوان جدول                                                                                                                            صفحه

 

جدول 3-1 مشخصات پرایمر برای جایگاه rs2254298 …………………………………………                        19

 

جدول 3-2 مقدار مواد مورد نیاز برای ساخت مخلوط PCR…………………………………….                        20

 

جدول 3-3- شرایط دمایی مورد نیاز PCR و پرایمرها……………………………………………………………..                       22

 

جدول 3-4-اندازه باندهای ایجاد شده توسط BsrӀ در پلی مورفیسم rs2254298……………                        23

 

جدول 3-5-مواد مورد نیاز برای برش مورد نظر  در جایگاه  rs2254298……………………..                        23

 

جدول 3-6- مشخصات پرایمر برای جایگاه rs53576……………………………………………                        25

 

جدول 3-7- اندازه باندهای ایجاد شده توسط BamH Ӏ در پلی مورفیسم rs53576…………                        26

 

جدول 3-8- مواد مورد نیاز مختص rs53576…………………………………………………….                        26

 

جدول 4-1- مشخصات دموگرافیک گروه های بیمار و کنترل………………………………………………….                       28

 

جدول 4-2- بررسی P-value ویژگی های دموگرافیک در دو گروه بیمار و کنترل…………………                      29

 

جدول 4-3-مقایسه فراوانی ژنوتیپی در پلی مورفیسم rs2254298…………………………….                        31

 

جدول 4-4-مقایسه فراوانی ژنی در پلی مورفیسم rs2254298…………………………………                        31

 

جدول 4-5- مقایسه فراوانی ژنوتیپی در پلی مورفیسم rs53576……………………………….                       33

 

جدول 4-6- مقایسه فراوانی ژنی در پلی مورفیسم rs53576…………………………………….                       33

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها

 

عنوان شکل                                                                                                                              صفحه

 

شکل 2ـ1ـ جایگاه ژنومی OXTR………………………………………………………………………..                                      11

 

شکل 2ـ2ـ مسیر سیگنالینگ PKC……………………………………………………………………                                     14

 

شکل 3ـ1ـ DNA استخراج شده از نمونه های خون بر روی ژل آگارز 1%………………………                              18

 

شکل 4ـ1ـ تصویر ژل آگارز %3 برای پلی مورفیسم rs2254298………………………..                                30

 

شکل 4ـ2ـ تصویر ژل آگارز %3 برای پلی مورفیسم rs53576……………………………………….                               32

 

 

 

 

 

 

 

فهرست علائم

 

 

 

1-3-4-3) محیط.. 23

 

1-3-4-4) اختلالات اکتسابی. 24

 

1-3-4-5) ارث.. 24

 

1-3-5) لجن صفراوی. 24

 

1-3-6)سنگ کلسترولی. 26

 

1-3-6-1) سنگ‌های پیگمانی. 26

 

تشخیص… 27

 

1-3-7) علائم بیماری سنگ کیسه صفرا. 28

 

1-3-7-1) سیر طبیعی. 29

 

درمان. 30

 

1-3-7-2) درمان جراحی. 30

 

1-3-7-3) درمان طبی- حل کردن سنگ کیسه صفرا 31

 

1-3-8) کله سیستیت حاد 32

 

1-3-8-1) مورفولوژی. 35

 

1-3-8-2) خصوصیات بالینی کوله سیستیت حاد 36

 

1-3-8-3) کله سیستیت بدون سنگ… 36

 

1-3-9) کله سیستوپاتی بدون سنگ… 37

 

1-3-10) کله سیستیت آمفیزماتو. 38

 

1-3-11-1) کله سیستیت مزمن. 38

 

1-3-11-2) مرفولوژی. 40

 

1-3-11-3) خصوصیات بالینی کوله سیستیت مزمن. 40

 

1-3-11-4) خصوصیات بالینی تشخیص کوله سیستیت حاد و مزمن. 40

 

1-4) اختلالات مجاری صفراوی خارج کبدی. 41

 

1-4-1) کوله دوکولیتاز و کلانژیت صعودی. 41

 

1-4-2) آترزی صفراوی خارج کبدی. 42

 

1-4-2-1) سیر بالینی. 43

 

1-4-3) تومورها 43

 

1-4-3-1-1) سرطان کیسه صفرا 43

 

1-4-3-1-2)مورفولوژی: 44

 

1-4-3-1-3) خصوصیات بالینی. 44

 

1-4-3-2) کارسینوم مجاری صفراوی خارج کبدی، از جمله آمپول واتر. 45

 

1-4-3-2-1) مورفولوژی. 45

 

1-4-3-2-2) خصوصیات بالینی. 46

 

فصل دوم: سوابق مربوط.. 49

 

فصل سوم: مواد و روشها 65

 

3-1) چکیده روش تحقیق. 66

 

3-1-2) جامعة مورد مطالعه 67

 

3-1-3) منطقه مورد پژوهش… 68

 

3-1-4) روش نمونه گیری. 72

 

3-2-1) آماده سازی  سنگ صفرا برای استخراج  DNA.. 74

 

3-2-2) آماده سازی  لایه مخاطی کیسه صفرا برای استخراج  DNA.. 74

 

3-2-3) آماده سازی مایع صفراوی برای استخراج  DNA.. 74

 

3-3) روش استخراج DNA  به روش کیت سینا ژن. 75

 

3-4) واکنش زنجیره ای پلیمرازی. 76

 

3-4-1)مواد 77

 

3-4-1-1) میكروتیوب ها و نوك سمپلرها 77

 

3-4-1-2) محلول بافری PCR  با غلظت 5X.. 77

 

77

 

3-4-1-4) Kcl 78

 

3-4-1-5) Tris Hcl 78

 

3-4-1-6) مخلوط نوكلئوزیدها (dNTPs) 78

 

3-4-1-7) Taq DNA polymerase. 79

 

3-4-1-7-1) DNA polymerase Smart 79

 

 

3-4-1-8) پرایمرها 79

 

3-4-1-9) سایز ماركر. 80

 

3-4-1-10) اتیدیوم بروماید. 81

 

3-4-1-11) Loading Buffer 81

 

3-4-1-12) ژل آگاروز 81

 

3-4-2) مواد لازم برای تهیه  TBE 1X.. 82

 

3-4-2-1) طرز تهیه بافر TBE 1X.. 82

 

3-4-3) نرم افزارهای مورد استفاده 82

 

3-9) ژل الكتروفورز محصولات PCR.. 90

 

3-10) کشت هلیکوباکتر. 91

 

3-11-1) بررسی میزان IgG هلیکوباکتر پیلوری در سرم خون. 92

 

3-11-2) شیکر الیزا 95

 

3-11-3) شوینده الیزا 96

 

3-11-4) خواننده الیزا 97

 

3-11-5) مراحل انجام آزمون الیزا که تقریبا در تمام انواع آن مشترک است عبارت است از 98

 

IgG.. 99

 

IgG.. 100

 

فصل چهارم: نتایج.. 102

 

4-1 ) نتایج مربوط به افراد مورد مطالعه در این پژوهش… 103

 

4-2) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت مزمن. 114

 

4-3) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت حاد 116

 

4-4) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در مایع صفرا گروه شاهد. 118

 

4-5) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی تست IgG هلیکوباکتر. 121

 

4-6) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی BMI 127

 

4-7) نتایج مربوط به ژن 16s rRNA هلیکوباکتر بیلیس… 131

 

4-8)  نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر هپاتیکوس.. 133

 

4-9) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پولوروم 133

 

4-10) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم در سنگ کیسه صفرا در بیماران کله سیستیت مزمن. 133

 

4-11) نتایج مربوط به کشت هلیکوباکتر. 133

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری.. 134

 

پیشنهادات.. 148

 

منابع. 149

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

 

جدول 2-1) گزارش سازمان بهداشت جهانی از برآورد بروز، مرگ و میر ، و میزان شیوع انواع سرطان در مردها و زن ها  در طول  5 سال[117] 62

 

جدول 2-2) گزارش سازمان بهداشت جهانی از برآورد بروز، مرگ و میر ، و میزان شیوع انواع سرطان در زن ها در طول  5 سال[117] 63

 

جدول 2-3) گزارش سازمان بهداشت جهانی از برآورد بروز، مرگ و میر ، و میزان شیوع انواع سرطان در زن ها در طول  5 سال[117] 64

 

جدول 3-1) نمونه ای از پرسشنامه مورد استفاده در این پژوهش… 70

 

جدول 3-2) فرم رضایت اخلاق پزشکی مورد تایید کمیته منطقه ای اخلاق پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان برای این تحقیق  71

 

جدول 3-3) مقادیر مواد لازم برای PCR ژن Hsp60 هلیکوباکتر پیلوری. 83

 

جدول3-4) برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر ژن Hsp 60 هلیکوباکتر پیلوری. 83

 

جدول 3-5) مقادیر مواد لازم برای PCR ژن s rRNA16 هلیکوباکتر پولوروم 85

 

جدول 3-6) برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر ژن  16s rRNAهلیکوباکتر پولوروم 85

 

جدول 3-7) مقادیر مواد لازم برای PCR ژن s rRNA 16هلیکوباکتر بیلیس… 87

 

جدول 3-8) برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر ژن 16s rRNA هلیکوباکتر بیلیس… 87

 

جدول 3-9) مقادیر مواد لازم برای PCR ژن s rRNA16 هلیکوباکتر هپاتیکوس.. 89

 

جدول 3-10) برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر ژن  s rRNA16هلیکوباکتر هپاتیکوس.. 89

 

جدول 3-11) مواد مورد نیاز برای ساخت محیط کشت بهینه سازی شده برای رشد فرم کوکوئید هلیکوباکتر پیلوری  92

 

جدول4-1-1) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس بیماران کله سیستیت حاد در گروه های سنی مختلف.. 105

 

جدول4-1-2) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن بیماران کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 106

 

جدول4-1-3) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد بیماران کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 107

 

جدول 4-1-4) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 108

 

جدول 4-1-5) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 109

 

جدول4-1-6) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 110

 

جدول 4-1-7) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس گروه شاهد در رده های سنی مختلف.. 111

 

جدول 4-1-8) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن گروه شاهد در ر ده های سنی مختلف.. 112

 

جدول 4-1-9) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد گروه شاهد در رده های سنی مختلف.. 113

 

 

 

 

 

فهرست تصاویر

 

تصویر3-1) –A موقعیت جغرافیایی استان اصفهان در ایران. B- نقشه جخرافیایی استان اصفهان. 69

 

تصویر3-2) ست جراحی کله سیستکتومی لاپراسکوپیک… 72

 

تصویر 3-3) دو روش کله سیستکتومی باز و لاپراسکوپیک… 73

 

تصویر3-4)کلانژیوپانکراتوگرافی برگشتی آندوسکوپیک… 73

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست نمودار

 

نمودار 4-1-1) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس بیماران کله سیستیت حاد در گروه های سنی مختلف.. 105

 

نمودار 4-1-2) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن بیماران کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 106

 

نمودار 4-1-3) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد بیماران کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 107

 

نمودار 4-1-4) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 108

 

نمودار 4-1-5) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 109

 

نمودار 4-1-6) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد بیماران کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 110

 

نمودار 4-1-7) مقایسه فراوانی نسبی هر دوجنس گروه شاهد در رده های سنی مختلف.. 111

 

نمودار 4-1-8) مقایسه فراوانی نسبی جنس زن گروه شاهد در ر ده های سنی مختلف.. 112

 

نمودار 4-1-9) مقایسه فراوانی نسبی جنس مرد گروه شاهد در رده های سنی مختلف.. 113

 

نمودار 4-2-1) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران زن و مرد کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 114

 

نمودار 4-2-2) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران زن کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 115

 

نمودار 4-2-3) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران مرد کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 115

 

نمودار 4-3-1) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران زن و مرد کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 116

 

نمودار 4-3-2) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران زن کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 117

 

نمودار4-3-3) مقایسه فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در مایع صفرا بیماران مرد کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 117

 

نمودار 4-4-1) مقایسه میزان فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در هر دو جنس گروه شاهد در رده های سنی مختلف   118

 

نمودار 4-4-2) مقایسه موارد مثبت hsp60 در مایع صفرا بیماران کله سیتیت مزمن با گروه شاهد در رده های سنی مختلف   119

 

نمودار 4-4-3) مقایسه موارد مثبت hsp60 در مایع صفرا بیماران کله سیتیت حاد با گروه شاهد در رده های سنی مختلف   119

 

نمودار 4-4-4) میزان فراوانی نسبی ژن hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در بافت کیسه صفرا زنان کله سیستیت حاد در رده های سنی مختلف.. 120

 

نمودار 4-5-1) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری  در هر دو جنس بیماران کله سیستیت حاد 121

 

نمودار 4-5-2) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری  در زنان بیمار کله سیستیت حاد 122

 

نمودار 4-5-3) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری  درمردان بیمار کله سیستیت حاد 122

 

نمودار 4-5-4) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری  در هر دو جنس بیماران کله سیستیت مزمن  123

 

نمودار 4-5-5) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در زنان بیمار کله سیستیت مزمن  123

 

نمودار 4-5-6) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری  در مردان بیمار کله سیستیت مزمن  124

 

نمودار 4-5-7) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری  در هر دو جنس گروه شاهد  125

 

نمودار 4-5-8) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در زنان گروه شاهد. 125

 

نمودار 4-5-9) میزان فراوانی نسبی نتایج مثبت و منفی تست IgG هلیکوباکتر پیلوری در مردان گروه شاهد. 126

 

نمودار4-6-1) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI در هر دو جنس بیمار کله سیستیت مزمن ، در رده های سنی مختلف.. 127

 

نمودار4-6-2) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI زنان بیمار کله سیستیت مزمن ، در رده های سنی مختلف   128

 

نمودار 4-6-3) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI مردان بیمار کله سیستیت مزمن ، در رده های سنی مختلف   128

 

نمودار 4-6-4) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI در هر دو جنس بیمار کله سیستیت حاد ، در رده های سنی مختلف.. 129

 

نمودار 4-6-5) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI زنان بیمار کله سیستیت حاد ، در رده های سنی مختلف   129

 

نمودار 4-6-6) مقایسه میزان فراوانی نسبی دسته های مختلف BMI مردان بیمار کله سیستیت حاد، در رده های سنی مختلف   130

 

نمودار 4-7-1) فراوانی نسبی ژن s rRNA16 هلیکوباکتر  بیلیس در مایع صفرا بیماران مرد کله سیستیت حاد 131

 

نمودار 4-7-2) بررسی فراوانی نسبی ژن  16 s rRNA هلیکوباکتر بیلیس در مایع صفرا بیماران زن کله سیستیت مزمن در رده های سنی مختلف.. 132

 

1-5-2- تحرک اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………………….12

 

1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم ……………………………………………………………………………………………………….14

 

1-5-4- قابلیت حیات اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….14

 

1-5-5- حجم………………………………………………………………………………………………………………………………………….15

 

1-5-6- غلظت………………………………………………………………………………………………………………………………………..16

 

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن………………………………………………………………………………………………………18

 

1-6-1- نکروز…………………………………………………………………………………………………………………………………………18

 

1-6-2- آپوپتوز سلولی…………………………………………………………………………………………………………………………..18

 

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ……………………………………………………………………………………………………………………….19

 

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………………………………………………………………….21

 

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز………………………………………………………………………………………….21

 

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………………………………………………………………..23

 

1-6-2-4-1-  بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………………………………………………23

 

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول……………………………………………………24

 

1-6-2-4-2-  بررسی سیتوتوکسیسیتی ………………………………………………………………………………………………24

 

1-6-2-4-3-  بررسی تغییرات مورفولوژی …………………………………………………………………………………………..25

 

1-6-2-4-3-1-  استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………………………………………………………25

 

1-6-2-4-3-2-  استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس………………………………………………………………..25

 

1-7-  منشاء آسیب DNA اسپرم…………………………………………………………………………………………………………26

 

1-7-1-  بسته بندی غیرطبیعی كروماتین……………………………………………………………………………………………27

 

1-8-  ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری …………………………………………………………………………28

 

1-8-1-  بررسی ساختار کروماتین اسپرم……………………………………………………………………………………………..28

 

1-9-  نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم………………………………………………………………………………………..29

 

1-10-  استرس اكسیداتیو به واسطه ROS…………………………………………………………………………………………30

 

1-11-  تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA  و میزان موفقیت روشهای کمک باروری…………………..31

 

1-11-1-  مصرف سیگار………………………………………………………………………………………………………………………..31

 

1-11-2-  مواجهات شغلی…………………………………………………………………………………………………………………….32

 

1-11-3-  داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………………………………………………………………33

 

1-11-4-  سن………………………………………………………………………………………………………………………………………..33

 

1-12-  تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین……………………………………………………………………………………….33

 

1-12-1-  روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………………………………………………………34

 

1-12-1-1- تست TUNEL……………………………………………………………………………………………………………….35

 

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………………………………………………………..35

 

1-12-1-3- روش Comet…………………………………………………………………………………………………………………..36

 

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3…………………………………………………………………………………………………………36

 

1-12-1-5- تكنیك SCSA………………………………………………………………………………………………………………..37

 

1-12-1-6- تست  SCD……………………………………………………………………………………………………………………..37

 

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ………………………………………………………………………………………………..39

 

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو………………………………………………………………………………………………….39

 

1-13- روش مهاجرت اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….39

 

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………………………………………………………………….40

 

فصل دوم- مواد و روش ها………………………………………………………………………………………………………………………41

 

2-1- مواد و وسایل  مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………42

 

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………….42

 

2-1-2- مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………………………..42

 

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………45

 

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10…………………………………………………………………………………………………….45

 

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………………………………………..46

 

2-2-3- ساخت محلول تانل……………………………………………………………………………………………………………………..46

 

2-2-4- ساخت محلول (PBS)……………………………………………………………………………………………………………….46

 

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین…………………………………………………………………………………………………….47

 

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………………………………………………………………..47

 

 

2-3- روشها………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48

 

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم…………………………………………………………………………………………………………….. 48

 

2-3-2- آنالیز مایع انزالی………………………………………………………………………………………………………………………… 48

 

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی…………………………………………………………………………………………………………..48

 

2-3-2-1-1-  ظاهر………………………………………………………………………………………………………………………………….48

 

2-3-2-1-2- آبکی کردن…………………………………………………………………………………………………………………………48

 

2-3-2-1-3-  حجم………………………………………………………………………………………………………………………………….48

 

2-3-2-1-4-  چسبندگی…………………………………………………………………………………………………………………………48

 

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی………………………………………………………………………………………………………….49

 

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………..50

 

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم…………………………………………………………………………………………………………..50

 

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش ………………………………………..50

 

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………………………………………………………………………51

 

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….52

 

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات…………………………………………………………………………………………………………53

 

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………………………………………………………53

 

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی………………………………………………………………………………………………………………54

 

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………………54

 

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………………………………………………………………..54

 

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………55

 

2-3-3-  Direct swim-up………………………………………………………………………………………………………………………57

 

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………….57

 

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)……………………………………………………………58

 

2-3-4-1- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………………58

 

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل…………………………………………………………………………………………………………………60

 

2-3-6- آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………………………………………….62

 

فصل سوم- نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………………..63

 

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی تحرک اسپرم………………………………64

 

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قابلیت حیات اسپرم………………….67

 

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی مورفولوژی اسپرم……………………..68

 

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70

 

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………….72

 

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی آپوپتوز اسپرم………………………………………………………………………………………………………………75

 

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم……………………………………78

 

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم…………………………………………………………………..79

 

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم…………………………………………..80

 

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………80

 

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………………………………………………………………….81

 

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم………………………………………83

 

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………..84

 

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….90

 

منابع

 

چکیده انگلیسی

 

 

 

فهرست شکل ها

 

عنوان                                                                                                          صحنه

 

1-1- ساختار اسپرم انسانی……………………………………………………………………………………………………………………..9

 

1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: …………..…………….…A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337

 

1-3- تست  SCD………………………………………………………………………………………………………………………………….38

 

2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون…………………………………………………………………………………………………………..50

 

2-2- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود………………………………………………51

 

2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER …………………………………………………………………………………….52

 

2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور…………………………………………………….57

 

3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم…………………………….67

 

3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا ………………………………………………………………………………………………………………….69

 

3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد……………………………………74

 

3-4- رنگ آمیزی TUNEL………………………………………………………………………………………………………………….76

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول ها

 

عنوان                                                                                                   صفحه

 

1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO)…………………………………………………………………………………………………………………………………….17

 

2-1- ساخت Ham’sf10……………………………………………………………………………………………………………………..45

 

2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………………………………………………55

 

3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ……………………………………………………..71

 

3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم……………………………………..77

 

3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………..77