3-2-1- علائم بروز دیابت——- 4

 

4-2-1- درمان دیابت :———- 5

 

3-1- گیاه جغجغه ((Prosopis farcta————– 8

 

1-3-1- خواص دارویی جغجغه— 8

 

4-1- فسفوفروکتوکیناز 1(PFK-1):—————- 9

 

5-1- ضرورت و اهداف تحقیق :- 13

 

فصل دوم: بر منابع

 

1-2- اثرات ضد دیابتی گیاهان– 16

 

1-1-2- انار-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 17

 

2-1-2-مكانیسم اثر انار در دیابت:————— 17

 

2-1-2- سیر—————- 19

 

2-2- اثر گیاه برفعالیت وبیان ژن—————- 21

 

فصل سوم: مواد و روشها

 

1-3- موادو روشها———— 25

 

2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه—- 27

 

3-3- حیوانات آزمایشگاهی—– 28

 

1-3-3- نحوه گروهبندی:—— 28

 

2-3-3- روش القای دیابت تجربی:————— 29

 

3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———– 29

 

4-3-3- مراحل انجام تشریح:— 29

 

4-3- بررسی بیان ژن———- 31

 

1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1————- 31

 

2-4-3- طراحی پرایمرها—— 35

 

3-4-3- آماده سازی پرایمر—– 35

 

5-3- استخراج RNA:——— 36

 

1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm—— 36

 

1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شدهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 38

 

6-3- سنتز cDNA———– 39

 

1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFICبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——— 39

 

7-3- واکنش های PCR——- 41

 

1-7-3 – PCR شیب دمایی—- 41

 

2-7-3- PCR معمولی——– 43

 

8-3- الکترفورز————— 45

 

1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز—- 45

 

1-1-8-3- آگارز————- 45

 

2-1-8-3- اتیدیوم بروماید—– 46

 

3-1-8-3- لودینگ بافر——– 46

 

4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl———— 46

 

4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA————- 47

 

9-3- روش کار با ژل الکترفورز– 47

 

10-3- رسم منحنی استاندارد:– 48

 

10-3- واکنش Real-Time PCR—————- 48

 

11-3- Threshold و مقدار CT:- 50

 

12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCRبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 51

 

10-2-3- آنالیز بیان ژن——- 52

 

13-3- تجزیه وتحلیل داده ها— 52

 

فصل چهارم: نتایج و بحث

 

1-4- جمع آوری نمونه :——- 54

 

2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه—— 54

 

3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——— 56

 

5-4- نتایج استخراج RNA:—- 57

 

6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 59

 

7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتریبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد— 61

 

 

1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی——- 61

 

8-4- نتایج منحنی استاندارد—- 62

 

1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP————– 63

 

2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1————- 63

 

9-4- نتایج واكنش  Real Time PCR———— 64

 

1-9-4- تکثیر ژنPFK——– 65

 

2-9-4-تکثیر ژن TBP——– 66

 

10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:———— 66

 

1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFKبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 67

 

2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———— 67

 

11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK————- 68

 

12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP————— 68

 

13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 70

 

14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK—————- 70

 

15-4- بحث:—————- 71

 

16-4- پیشنهادات———— 73

 

منابع:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 75

 

 

 

 

 

جدول1-3- تجهیزات و دستگاهها……………………………………………………………………………………………….. 26

 

جدول 2-3 پرایمرهای طراحی شده…………………………………………………………………………………………… 35

 

جدول3-3- لیست اجزای کیت استخراج RNA……………………………………………………………………….. 36

 

جدول 4-3 موادلازم برای PCR………………………………………………………………………………………………….. 42

 

جدول 5-3 برنامه PCR شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل از TBP…………………………………. 42

 

جدول 6-3 برنامه PCR  شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل از PFK-1…………………………… 43

 

جدول7-3 مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Tris-Hcl……………………………………………………………………. 47

 

جدول8-3 مواد و میزان مورد نیاز برای یک واکنش در Real-Time PCR…………………………….. 49

 

جدول9-3 مراحل، دما و زمان مربوطه در یک واکنش Real- time PCR  برای ژن TBP……… 50

 

جدول10-3- شرایط دمایی و زمانی واکنش Real time PCR برای ژن PFK-1………………….. 50

 

 

 

شکل 1-1- محل قرارگرفتن فسفوفروکتوکیناز 1 در کروموزوم شماره 21 انسان…………………. 10

 

شکل2-1- فروکتوز 2-6 بی فسفات مهمترین فعال کننده آنزیم فسفوفروکتوکیناز 1…………. 11

 

شکل3-1- مراحل گلیکولیز…………………………………………………………………………………………………………. 12

 

شکل 1-3- نحوه گاواژ دادن عصاره…………………………………………………………………………………………….. 28

 

شکل 2-3-  تشریح موشها…………………………………………………………………………………………………………… 30

 

شکل 3-3- توالی ژن pfk-1…………………………………………………………………………………………………………. 34

 

شکل 4-3- دستگاه اسپکتوفتومتری…………………………………………………………………………………………… 39

 

شکل 5-3 دستگاه PCR  (Eppendorf –mastercyc gradient)…………………………………………….. 44

 

شکل 6-3 دستگاه الکتروفورز وعکس ژل…………………………………………………………………………………… 48

 

شکل 7-3 دستگاه Real-Time PCR…………………………………………………………………………………………. 49

 

شکل 1-4- فراوانی موشهای مورد مطالعه………………………………………………………………………………….. 54

 

شکل 2-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر وزن موشهای صحرایی……….. 55

 

شکل 3-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر گلوکز ناشتای موشهای صحرایی 57

 

شکل 5-4- نتایج استخراج Total RNA……………………………………………………………………………………. 59

 

1-11-3) طبقه بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………………………………………………………..17

 

1-12) مواردکاربرد آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………………………………………24

 

1-13) ماکرولیدها…………………………………………………………………………………………………………………………………………..27

 

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………………………………………………………30

 

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………………..31

 

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..32

 

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………32

 

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………33

 

1-19) فارماکوکینتیک…………………………………………………………………………………………………………………………………..34

 

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………34

 

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………35

 

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………36

 

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین………………………………………………………………………………..36

 

1-24) مراحل کلیدی فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……………………………………………….38

 

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………………………………………………………39

 

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن………………………………………………………….44

 

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding ………………………………………………………………………………..45

 

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation ………………………………………………………………………………………………47

 

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………………………….48

 

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک…………………………………………………………………………………………………………….48

 

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار………………………………………………………………………………………………………….49

 

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……50

 

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………………………………….50

 

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی……………………………………………………………………………………………………………………..51

 

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی………………………………………………………………………………………………………………….55

 

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………………………………………………………….57

 

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………………………………………………………….57

 

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده…………………………………………………………………………………………………………..59

 

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد………………………………………………………………………………………….61

 

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها…………………………………………………………………………………………………………………….61

 

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها…………………………………………………………………………………….61

 

1-24-4-2-2) تأثیر pH………………………………………………………………………………………………………………………………62

 

1-24-4-2-3) تأثیر دما………………………………………………………………………………………………………………………………..64

 

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی…………………………………………………………………………………………………………………………67

 

1-24-4-2-5) تأثیر هم زدن………………………………………………………………………………………………………………………..68

 

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن…………………………………………………………………………………………………………..71

 

1-24-4-2-7) تأثیر کف……………………………………………………………………………………………………………………………….71

 

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………………………………………………………..73

 

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته……………………………………………………………………………………………………………………74

 

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………………………………………………….76

 

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول…………………………………………………………………………………………………..77

 

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………………………..79

 

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن……………………………………………………………………………………………..79

 

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………80

 

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا……………………………………………………………………………………………………………81

 

1-25-4) سویا در ایران………………………………………………………………………………………………………………………………….82

 

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا……………………………………………………………………………………………………………………….82

 

1-25-6) کنجاله سویا……………………………………………………………………………………………………………………………………83

 

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………………………….83

 

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………………………………………………….84

 

1-26-2) تاریخچه کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………………..85

 

1-26-3) تولید جهانی کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………….86

 

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………86

 

 

فصل دوم : بر متون گذشته

 

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………………………..88

 

فصل سوم : مواد و روش ها

 

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش……………………………………………………………………………………………..93

 

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش………………………………………………………………………………………………..93

 

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………….94

 

3-4) محیط های کشت مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………………95

 

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………………………………………………………95

 

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………………………………………….98

 

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)……………………………………………………………99

 

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………………………………………………….100

 

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر…………………………………………………………………………………………………………….104

 

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر………………… ……..105

 

3-5) نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………….106

 

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده……………………………………………………………………………………………………….106

 

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 ………………………………………………………………………………………107

 

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 ……………………………………..108

 

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4…………………………………………………………………………………………..108

 

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو……………………………………………………………………………………………………………….108

 

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین……………………………………………………………………………………..109

 

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با استفاده از کلروفرم…………………………………………………………111

 

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو…………………………………………………………………..112

 

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………………..113

 

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………………………….113

 

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار………………………………………………………………………………………………………113

 

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث……………………………………………………………………………………………………..114

 

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………..114

 

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………………………………..114

 

3-7-5) تهیه مایع تلقیح………………………………………………………………………………………………………………………………115

 

3-7-6) تهیه چاهک…………………………………………………………………………………………………………………………………….116

 

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8………………………………………………………………………………………………………………116

 

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………………………………….116

 

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها……………………………………………………………………………….117

 

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد…………………………………………………………………………………………………..117

 

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………………………………………………………….117

 

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا…………………………………………..118

 

3-8-1) فاز متحرک……………………………………………………………………………………………………………………………………..118

 

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………………………………………………………118

 

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین……………………………………………………………………………………………………..119

 

3-9) کروماتوگرافی لایه نازک TLC …………………………………………………………………………………………………………119

 

فصل چهارم: نتایج پژوهش

 

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین ( محیط شاهد )…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..123

 

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………………………………….123

 

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)…………………………………………………………………..124

 

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………………………………………125

 

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل)…..125

 

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین……………………………………………….128

 

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………………………………..129

 

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی…………………………………………………130

 

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی…………………………….130

 

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………..131

 

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر……………………………………………………………………………………………………132

 

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین…………………………………………………………………..132

 

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر…………………………………………………………….133

 

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی…………………………………………………………………133

 

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea…………………134

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…..137

 

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…………………………………………………………………………………..137

 

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………………………………………..138

 

5-2) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین……………………………….144

 

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرآیند…………………………………………………….145

 

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی………………………………………………………………………………………………………………….146

 

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر………………………..148

 

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین…………………………………………………………………….149

 

5-6) برآورد هزینه ها……………………………………………………………………………………………………………………………………153

 

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..153

 

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر…………………………………………154

 

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا……………………..154

 

5-7) پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………..156

 

 

 

منابع و مراجع…………………………………………………………………………………………………………………..158

 

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………….165

 

ضمائم …………………………………………………………………………………………………………………………….166

 

 

 

 

 

 

 

عنوان                                      فهرست جداول                                      صفحه

 

(جدول 1-1) گروه های میکروبی تولید کننده آنتی بیوتیک………………………………………………………………………..14

 

(جدول 1-2) برخی آنتی بیوتیک های مهم و مکانیسم عمل آنها………………………………………………………………..23

 

(جدول 1-3) مواد معدنی به کار رفته در محیط کشت…………………………………………………………………………………60

 

(جدول 1-4) محدوده دمایی رشد میکروارگانیسم های مختلف…………………………………………………………………..64

 

(جدول 1-5) تأثیر دی اکسید کربن بر تولید سیزومیسین در طی فرآیند تخمیر……………………………………….71

 

(جدول 3-1) محیط کشت اسپورزایی ISP medium 2…………………………………………………………………………..95

 

(جدول 3-2) محیط کشت اسپورزایی CSL ……………………………………………………………………………………………….96

 

(جدول3-3) ترکیبات محلول میکروالمنت…………………………………………………………………………………………………….96

 

(جدول3-4) ترکیبات محیط کشت بذردهی……………………………………………………………………………………………….99

 

(جدول3-5) ترکیبات محیط کشت تخمیر………………………………………………………………………………………………….104

 

(جدول3-6) مقادیر کنجاله سویا و کنجاله کلزا در محیط های تخمیر………………………………………………………106

 

(جدول3-7) محلول های نهایی اریترومایسین استاندارد…………………………………………………………………………….111

 

(جدول5-1) آنالیز ترکیبی کنجاله سویا افزوده شده به محیط کشت تخمیردر این پژوهش……………………139

 

(جدول5-2) آنالیز ترکیبی کنجاله کلزای افزوده شده به محیط کشت تخمیردر این پژوهش………………….140

 

(جدول5-3) اسیدآمینه های ضروری کنجاله سویا استفاده شده در این پژوهش……………………………………..140

 

(جدول5-4) اسیدآمینه های غیر ضروری کنجاله سویا استفاده شده در این پژوهش………………………………141

 

(جدول5-5) اسیدآمینه های ضروری کنجاله کلزا استفاده شده در این پژوهش……………………………………….141

 

(جدول5-6) اسیدآمینه های غیر ضروری کنجاله کلزا استفاده شده در این پژوهش………………………………..142

 

 

 

 

 

عنوان                                     فهرست نمودارها                                     صفحه

 

(نمودار 4-1) تغییرات pH در طول فرآیند تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت کنترل…………………………..123

 

(نمودار 4-2) تغییرات درصد بیومس در طول فرآیند تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت کنترل ( منحنی رشد باکتری )………………………………………………………………………………………………………………………………………………..124

 

( نمودار 4-3) میزان تولید اریترومایسین در محیط کشت کنترل……………………………………………………………..125

 

(نمودار 4-4) اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا روی pH محیط کشت در روزهای نمونه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………129

 

(نمودار 4-5) تغییرات درصد وزن تر بیومس تولیدی در محیط کشت تخمیر در روزهای مختلف و تمامی غلظت ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..130

 

(نمودار 4-6) تغییرات غلظت تولیدی اریترومایسین در محیط کشت تخمیر در روزهای مختلف و تمامی غلظت ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..131

 

(نمودار 4-7) تولید اریترومایسین در طول فرآیند در محیط کشت حاوی غلظت بهینه……………………………132

 

(نمودار 4-8) تغییرات pH درطی فرآیند تولید اریترومایسین در محیط کشت تخمیر حاوی غلظت بهینه……….133

 

(نمودار4-9) تغییرات درصد وزن تر بیومس تولیدی درطی فرآیند تولید اریترومایسین در محیط کشت تخمیر حاوی غلظت بهینه……………………………………………………………………………………………………………………………134

 

 

 

 

 

 

 

عنوان                                      فهرست اشکال                                      صفحه

 

(شکل1-1) اریترومایسین و الئاندومایسین، نمونه ای از ماکرولیدهای 14 عضوی……………………………………….27

 

(شکل1-2) مسیر کلی بیوسنتز اریترومایسین……………………………………………………………………………………………….29

 

(شکل1-3) ساختار شیمیایی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………….31

 

(شکل1-4) نمونه ای از یک فرمانتور همزن دار…………………………………………………………………………………………….50

 

(شکل1-5) شمایی از یک راکتور مجهز به همزن………………………………………………………………………………………….69

 

(شکل1-6) یک دستگاه تخمیر مجهز به سیستم تزریق هوا…………………………………………………………………………70

 

(شکل1-7) نمونه ای از کف شکن های مکانیکی………………………………………………………………………………………….72

 

(شکل1-8) کشتزار کلزا در کلاله ایران…………………………………………………………………………………………………………86

 

(شکل 3-1) تصویری از آمپول لیوفیلیزه حاوی سویه باکتری Saccharopolyspora erythraea ….93

 

(شکل3-2) تصویری از اسپورهای تشکیل شده بر روی محیط اسپورزایی CSL در روز 10 …………………….98

 

(شکل3-3) تصویری از واکنش رنگی اریترومایسین تولیدی و محلول بروموفنل بلو………………………………….112

 

(شکل 3-4) کروماتوگرافی لایه نازک…………………………………………………………………………………………………………..120

 

(شکل3-5) کروماتوگرافی لایه نازک…………………………………………………………………………………………………………..121

 

(شکل4-1) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز چهارم تخمیر……..126

 

(شکل4-2) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز ششم تخمیر……….126

 

(شکل 4-3) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز هشتم تخمیر…….127

 

(شکل4-4) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز دهم تخمیر………..127

 

(شکل 4-5) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز یازدهم تخمیر…..128

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

چکیده

 

امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر  نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و  پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ای Saccharopolyspora erythraea   استفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 44 ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه 8/6 در شیکر انکوباتوردار با دمای 33 درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت 11 روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :

 

بر مطالعات گذشته. 1

 

1-1 سلول­های بنیادی جنینی.. 3

 

1-2 سلول­های بنیادی بالغ. 4

 

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان. 5

 

1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

 

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

 

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 10

 

1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 14

 

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها 17

 

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک… 17

 

1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک… 18

 

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20

 

و اتصال نوروتروفین.. 20

 

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین.. 22

 

1-6 سلول­های بنیادی عصبی.. 25

 

1-6-1 نوروسفر. 25

 

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31

 

1-7 ضرورت اهداف تحقیق.. 33

 

. 35

 

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36

 

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ. 36

 

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت    a-MEM.. 36

 

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH) 37

 

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA. 37

 

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان. 39

 

2-2-5 پاساژ سلولی.. 39

 

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی.. 39

 

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71. 40

 

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%. 41

 

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد. 41

 

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%. 41

 

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH). 42

 

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول.. 42

 

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز 43

 

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی.. 44

 

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی.. 45

 

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین.. 46

 

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده 46

 

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 48

 

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز 49

 

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-) 52

 

2-6-5 انتخاب پرایمر. 53

 

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها 54

 

2-6-7 واكنش PCR. 54

 

2-7 آنالیز آماری.. 58

 

… 59

 

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59

 

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز. 60

 

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت.. 60

 

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی.. 60

 

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین.. 61

 

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن 61

 

70

 

 

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها 71

 

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 72

 

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی.. 74

 

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت.. 76

 

4-5 نتیجه گیری.. 77

 

پیشنهادات.. 77

 

مراجع   79

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل­ها

 

 

 

تنظیم می­شود.. 22

 

P75NTR. 23

 

شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trk تنظیم می­شود. 24

 

شکل 1-4. سلول­های بنیادی عصبی و رده­های سلولی مربوط به آن.. 25

 

 شکل 1-5 .ارزیابی شکل­گیری نوروسفر. 26

 

 شكل 1. تصاویر فاز كنتراست سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی در محیط كشت در پاساژهای مختلف. 62

 

 شكل 2. شناسایی سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی.. 63

 

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته   64

 

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم  MSCs پس از هفته سوم. 65

 

شکل4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی  66

 

 شکل 5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین  66

 

شكل6 A.الگوی بیان ژن­ فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و B: گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67

 

شكل 6. C الگوی بیان ژن پیش­ساز عصبی و ژن­های اختصاصی سلول­های دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت).    67

 

 نمودار 6 A.  مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.. 68

 

 نمودار6  B.مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول­ها

 

 

 

جدول1-1 . اسامی گوناگون سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 6

 

جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرایمرها، F : پرایمر بالادست ، R : پرایمر پایین‌دست.. 57

 

 

 

مقدمه

 

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

 

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

 

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

 

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

 

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

 

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

 

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

 

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یك منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

 

1-4-2  انتقال مکانیکی……………………………………………………………………………………………………………………… 19

 

1-4-3 انتقال از راه خون…………………………………………………………………………………………………………………… 19

 

1-4-4 انتقال مستقیم……………………………………………………………………………………………………………………….. 19

 

1-5 بیماری­زایی لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………………………… 20

 

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………. 19

 

1-5-2 لیشمانیوز احشایی…………………………………………………………………………………………………………………. 20

 

1-5-3  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)……………………………………………………………………… 21

 

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………………………………………. 22

 

1-5-3-2  لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………………………………………………. 22

 

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب… 22

 

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………… 23

 

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)…………….. 24

 

1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………………………………………… 24

 

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………. 25

 

1-6-1  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی……………………………………………………………………. 25

 

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………………………………………… 25

 

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی………………………………………………………………………… 26

 

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………………………………….. 26

 

1-6-1-3  عملکرد T-CELL……………………………………………………………… 27

 

1-6-2  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی…………………………………………………………………… 28

 

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار………………………………………………………………………………………. 28

 

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………………………………………… 28

 

4……………………………………………………. 29

 

1-7  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………………………………………….. 30

 

1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل…………………………………………………………………………………………… 30

 

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………………………… 31

 

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………………………………………………….. 31

 

1-7-1-2 کشت انگل………………………………………………………………………………………………………………………… 32

 

1-7-2  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل………………………………………………………………………………… 32

 

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………………………………… 32

 

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی………………………………………………………. 33

 

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………………………………………………. 33

 

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)……………………………………………………. 34

 

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو…………………………………………………………………………. 35

 

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………………………………… 35

 

…………………….. 37

 

: بر متون گذشته

 

مواد و روشها

 

3-1کشت انگل……………………………………………………………………………………………………………………………………. 43

 

3 -1-1  مواد مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………………………………………….. 43

 

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………………………………………… 43

 

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640‌………………………………………………………………….. 44

 

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل……………………………………………………………………………………………….. 44

 

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………… 44

 

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………….. 45

 

3-1-7. روش كشت انگل…………………………………………………………………………………………………………………… 45

 

3-1-8. روش شمارش سلولها……………………………………………………………………………………………………………. 46

 

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل…………………………………………………………………………. 46

 

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار………………………………………………………………………………………………………… 46

 

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay………………………………………. 47

 

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………….. 48

 

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay……………………………………………… 48

 

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………………………………………… 50

 

 

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………………………………………. 50

 

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…………….. 52

 

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )………………………. 53

 

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………………………………….. 53

 

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………………………………………………… 54

 

3-5-3  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE…………………………………………………………………… 54

 

3-5-4 آماده­سازی نمونه……………………………………………………………………………………………………………………. 57

 

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود……………………………………………………………………………………………………………. 57

 

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE………………………………………………………… 58

 

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250………………………………………….. 59

 

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:…………………………………………………………………………… 59

 

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………….. 60

 

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford………………………………………. 60

 

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………………………………………. 61

 

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………….. 62

 

3-7-1 روش انجام تست L.T.T……………………………………………………………. 63

 

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T…………………………………….. 64

 

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………………………………………….. 66

 

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی……………………………………………………….. 67

 

3-8-2  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………………………………………… 67

 

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………. 69

 

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH……………….. 69

 

3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………………………………………… 69

 

3-9-3  نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………… 70

 

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution…………………….. 72

 

4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها………………………………………………………………………. 72

 

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford……………………………….. 73

 

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T…………………………………………………………….. 74

 

4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B……………………………………………. 74

 

4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C……………………………………………. 75

 

4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………… 76

 

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)…………………………………….. 76

 

4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A 77

 

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………… 79

 

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی……………………………………………………. 79

 

4-5-1  نتایج تست DTH 24 ساعته……………………………………………………………………………………………. 79

 

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته…………………………………………………………………………………………….. 82

 

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته…………………………………………………………………………………………….. 83

 

95

 

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………….. 106

 

فهرست اشکال و جداول و نمودارها

 

عنوان                                                                                                                           صفحه

 

شکل 1-1. اشکال مختلف انگل های لیشمانیا ………………………………………………………………………………… 11

 

شکل1-2. پروماستیگوت لیشمانیا (خارج سلولی) …………………………………………………………………………… 14

 

شکل -1-3. اشکال اماستیگوت و پروماستیگوت …………………………………………………………………………….. 15

 

شکل 1-4. پشه خاکی ………………………………………………………………………………………………………………………. 17

 

شکل1-5. چرخه زندگی لیشمانیا در میزبان مهره دار …………………………………………………………………… 18

 

شکل 1-6.. اشکال مختلف لیشمانیوز جلدی (سالک) ……………………………………………………………………. 24

 

شکل 1-7. بلعیده شدن پروماستیگوت لیشمانیا توسط یک سلول ماکروفاژی …………………………….. 28

 

شکل3-1. شکل شماتیک لام نئوبار …………………………………………………………………………………………………. 48

 

جدول3-1. جدول تهیه  ژل جدا کننده پایین SDS-PAGE ………………………………………………….. 56

 

جدول3-1. جدول تهیه  ژل جدا کننده بالا SDS-PAGE ……………………………….. 57

 

جدول3-1. جدول تنظیم رقت دستگاه spect ……………………………………………………………………………… 62

 

شکل 4-1. پروفایل پروتئینی باندهای حاصل از تک­کلون­ها در مقایسه با نمونه لیشمانین استاندارد…………. 74

 

جدول 4-1. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنB ……………………………………………………. 75

 

جدول 4-2. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن c……………………………………………………. 76

 

جدول 4-3. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنی D……………………………… 77

 

جدول 4-4. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنیM…………………………………………………… 78

 

جدول 4-5. مقایسه نتایج اندکس تحریکی به دست آمده در حضور نمونه­های آنتی­ژنی تک کلونی

 

و Con-A…………………………………………………………………………………… 79

 

نمودار1-4. نتایج میانگین اندکس تحریکی هر یک از تک کلون­ها در تست L.T.T………….. 80

 

جدول4-6.  میانگین تست­های DTH ،24 ساعته………………………………………………………………………… 81

 

نمودار 2-4. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 24 ساعت ………………………………………. 81

 

جدول4-7.  میانگین تست­های DTH ، 48 ساعته ……………………………………………………………………….. 82

 

نمودار 4-3. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 48 ساعت ………………………………………. 82

 

جدول4-8.  میانگین تست­های DTH ،72ساعته ………………………………………………………………………… 83

 

نمودار 4-4. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 72 ساعت …………………………………………. 83

 

 

 

 

 

 

 

 

 

خلاصه فارسی

 

 

 

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

 

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

 

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­کلون­های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

 

 

 

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژن C نشان داد.

 

2-1- خلیج فارس.. 13

 

2-2- استان بوشهر.. 14

 

2-3- نفت و آلودگی‌های نفتی.. 15

 

2-4- ورود نفت به آب دریا.. 17

 

2-5- تغییرات نفت پس از ورود به آب دریا.. 17

 

2-5-1 پراکنده شدن.. 18

 

2-5-2 پخش شدن مواد نفتی در سطح آب.. 18

 

2-5-3 حل شدن.. 18

 

2-5-4 تبخیر شدن.. 18

 

2-5-5 اکسیداسیون فتوشیمیایی.. 18

 

2-5-6 بحالت امولسیون در آمدن.. 19

 

2-5-7 قابلیت تجزیه زیستی.. 19

 

2-5-8 ته نشین شدن.. 19

 

2-6- تجزیه‌زیستی.. 20

 

2-7- معرفی هیدروکربن‌های آروماتیک.. 20

 

2-7-1 طبقه‌بندی ترکیبات آروماتیک.. 20

 

2-7-2 فرمولاسیون ترکیبات آروماتیک.. 21

 

2-7-3 خواص فیزیکی و شیمیایی.. 22

 

2-7-4 درجه سمیت ترکیبات آروماتیک.. 23

 

2-7-5 اثرات هیدروکربن‌های پلی‌آروماتیک روی سلامتی انسان‌ها و موجودات زنده.. 27

 

2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان.. 27

 

2-7-7 چه عاملی ترکیب را سرطان‌زا می‌کند؟.. 27

 

2-8- فنل.. 28

 

2-8-1 کلیات ترکیب فنل.. 28

 

2-8-2 نام‌گذاری.. 28

 

2-8-3 فنول‌های طبیعی.. 29

 

2-8-4 ساختمان مولکولی و خواص فیزیکی.. 29

 

2-8-5 خواص فیزیکی.. 29

 

2-8-6 تأثیر فنل بر محیط زیست و موجودات زنده.. 30

 

2-8-7 کاربردها.. 30

 

2-9- تجزیه‌زیستی.. 30

 

2-9-1 روش‌های پاکسازی بیولوژیکی.. 31

 

2-9-2 مبانی زیست‌درمانی.. 32

 

2-9-3 میکروارگانیسم‌های هوازی.. 32

 

2-9-4 میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی.. 32

 

2-9-5 مخمرها و قارچ‌ها.. 33

 

2-9-6 استفاده از بیوراکتور‌ها.. 33

 

2-9-7 کو‌متابولیسم.. 34

 

2-9-8 دی‌نیتریفیکاسیون.. 34

 

2-9-9 کمپوست کردن.. 34

 

2-9-10 درمان بیولوژیکی.. 34

 

2-10- میکروارگانیسم های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک.. 35

 

2-11- مسیر های تجزیه زیستی.. 36

 

2-11-1 تجزیه میکروبی فنل.. 36

 

2-11-2 تجزیه میکروبی نفتالین.. 39

 

فصل سوم: روش شناسی تحقیق

 

3-1- محیط کشت‌های مورد استفاده.. 44

 

3-1-1 محیط ONR7a. 44

 

3-1-2 محیط (ONR7a + نفتالین) آگار.. 45

 

3-1-3 محیط) +ONR7a فنل( آگار.. 45

 

3-1-4 محیط مارین براث (MB).. 45

 

3-1-5 محیط مارین آگار (MA).. 46

 

3-1-6 محیط نوترینت براث (NB).. 46

 

 

3-1-7 محیط نوترینت آگار (NA).. 46

 

3-2- محلول‌ها.. 47

 

3-2-1 سرم فیزیولوژی.. 47

 

3-2-2 محلول اتیلن‌دی‌‌آمینو‌تترا‌استیک‌اسید (EDTA).. 47

 

3-2-3 محلول Tris-Base. 48

 

3-2-4 محلول TBE.. 48

 

3-2-5 محلول   EDTA Tris-Base- (TE) 48

 

3-2-6 محلول اتیدیوم بروماید.. 48

 

3-3- مواد مصرف شده در PCR.. 49

 

3-4- دستگاه‌های مورد استفاده.. 49

 

3-5- روش عملی.. 50

 

3-5-1 نمونه برداری به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده   50

 

3-5-2 شمارش باکتری های موجود در محیط.. 51

 

3-5-2-1 شمارش باکتری های هتروتروف.. 51

 

3-5-2-2 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده نفتالین.. 51

 

3-5-2-3 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل.. 51

 

3-5-3 جداسازی باکتری های تجزیه کننده.. 51

 

3-5-3-1 جداسازی و غربالگری باکتری های  تجزیه کننده.. 51

 

3-5-3-2 تست های تکمیلی.. 52

 

3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتری.. 52

 

3-5-3-2-2 فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24) 52

 

3-5-3-2-3  سنجش حذف فنل.. 52

 

3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالین.. 52

 

3-5-4 شناسایی باکتری ها.. 53

 

3-5-4-1 استخراج DNA ژنومی با روش فنل کلروفورم.. 53

 

3-5-4-2 تعیین غلظت DNA استخراج شده.. 54

 

3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR.. 54

 

3-5-4-4 بررسی محصول PCR.. 54

 

3-5-4-5BLAST  کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها.. 55

 

 

 

 

 

فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق

 

4-1- نمونه برداری.. 57

 

4-2- شمارش باکتری ها.. 58

 

4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها.. 58

 

4-2-2 شمارش تعداد کل تجزیه کننده‌ها.. 60

 

4-3- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین.. 61

 

4-4- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده.. 62

 

4-4-1 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل.. 62

 

4-4-2 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده نفتالین.. 62

 

4-5- تست‌های تکمیلی جهت انتخاب باکتری‌هایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین.. 63

 

4-5-1 سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین   63

 

4-5-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24).. 67

 

4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک.. 71

 

4-5-3-1 سنجش حذف نفتالین.. 71

 

4-5-3-2 سنجش حذف فنل.. 73

 

4-6- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک   75

 

4-6-1 بررسی محصول PCR.. 75

 

4-6-2 BLAST کردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها.. 76

 

4-7- رسم درخت فیلوژنی برای سویه‌ها.. 92

 

4-8- فاصله ژنتیکی بین سویه‌ها.. 94

 

 

 

 

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1- بحث و نتیجه گیری.. 97

 

5-2- پیشنهادات.. 100

 

منابع و مآخذ.. 101

 

فهرست منابع فارسی.. 101

 

فهرست منابع انگلیسی.. 103

 

چکیده انگلیسی.. 108

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

 

عنوان                                                  شماره صفحه

 

جدول 2-1: 28 ترکیبات آروماتیک به ترتیب میزان سمیت. 23

 

جدول 3-1: ترکیبات محیط کشت ONR7a. 44

 

جدول 3-2: ترکیبات محیط کشت مارین براث (MB) 45

 

جدول 3-3: ترکیبات محیط کشت نوترینت براث. 46

 

جدول 3-4: ترکیبات سرم فیزیولوژی. 47

 

جدول 3-5: ترکیبات سرم فیزیولوژی. 47

 

جدول 3-6: توالی و خصوصیات پرایمر‌های مورد استفاده جهت شناسایی ژن 16 SrRNA.. 49

 

جدول 3-7: دستگاه های مورد استفاده و مدل آنها. 49

 

جدول 3-8: غلظت مواد مورد استفاده در  PCR با پرایمرهایAlk  54

 

جدول 4-1: نامگذاری و معرفی نقاط نمونه گیری بر حسب مشخصات جغرافیایی  57

 

جدول 4-2: نتایج شمارش باکتری‌های هتروتروف. 59

 

جدول 4-3: نتایج شمارش کل باکتری های تجزیه کننده. 60

 

جدول 4-4: نتایج میزان جذب نوری نمونه‌های تجزیه‌کننده فنل در طول موج 600 نانومتر. 64

 

جدول 4-5: نتایج میزان جذب نوری نمونه‌های تجزیه‌کننده نفتالین در طول موج 600 نانومتر. 65

 

جدول 4-6: نتایج تست E24 برای نمونه‌های تجزیه‌کننده نفتالین  68

 

جدول 4-7: نتایج تست E24 برای نمونه‌های تجزیه‌کننده فنل. 70

 

جدول 4-8: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف نفتالین. 72

 

جدول 4-9: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف فنل. 74

 

جدول 4-10: برنامه رسم درخت فیلوژنی سویه ها. 92

 

جدول 4-11: برنامه رسم جدول فاصله های ژنتیکی سویه ها. 94

 

جدول 4-12: فاصله ژنتیکی سویه ها. 94

 

 

 

فهرست نمودارها

 

عنوان                                                    شماره صفحه

 

نمودار 2-1: مسیر تجزیه میکروبی فنل. 36

 

نمودار 2-2: مسیر تجزیه میکروبی نفتالین. 39

 

نمودار 4-1: درصد حذف فنل توسط سویه‌های تجزیه‌کننده این ترکیب   73

 

نمودار 4-2: درصد حذف فنل توسط سویه‌های تجزیه‌کننده این ترکیب   74

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها

 

عنوان                                                   شماره صفحه

 

شکل 2-1: فرمول ککوله حلقه بنزن. 21

 

شکل 2-2: فرمول ساختاری بنزن. 21

 

شکل 2-3: نمایش موقعیت جانشینی روی حلقه دی متیل بنزن. 21

 

شکل 2-4: برخی از آروماتیک های چند هسته ای فشرده. 22

 

شکل 2-5: فرمول تترالین یا تتراهیدرونفتالن. 22

 

شکل 2-6: مکانیسم های بروز سرطان. 26